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专利名称:光可断裂的标记核苷酸和核苷与标记的核苷酸和核苷以及其在dna测序中的使用方法
技术领域:
本发明一般涉及用于DNA测序和其它类型DNA分析的化合物和方法。更具体而言,本发明涉及利用光可断裂基团标记的核苷酸和核苷、利用不可断裂基团标记的核苷酸和核苷以及其在DNA测序和分析中的使用方法。
背景技术:
快速DNA测序方法已经成为分析种群中疾病和突变以及开发治疗方法的需求。最常观察到的人序列变异形式是单核苷酸多态性(SNP),其以大约1/300至1/1000个基因组序列碱基对而存在。基于人基因组全序列,正在努力通过绘制SNP谱或直接关联来确认成为常见疾病原因的基因关联。基于快速、高通量和低成本的DNA测序技术的开发将促进对遗传信息(例如SNP)在应用医学中的理解和应用。一般而言,10%-15%的SNP将通过改变特定氨基酸残基来影响蛋白质功能、通过改变剪切机制来影响对基因的适当加工、或者通过改变调节机制来影响基因或蛋白质的正常表达水平。设想信息性SNP的鉴定将导致对遗传病的更准确诊断、对风险易感性的更好预测、或对组织中偶发性突变的识别。个体SNP特性的一个应用将是利用预防性药物治疗来显著延迟疾病的发生或进展。此外,药物代谢基因的
SNP特性可用于制定具体的给药方案以提供更安全和更有效的结果。为实现这些宏大的目标,基因组测序将进入具有对大多数种群进行部分测序可能性的重测序(resequencing)阶段,其将涉及对特定区域或分布在整个人类基因组中的单碱基对进行平行测序以获得特定复杂疾病的SNP特性。成为大多数常见疾病原因的序列变异很可能与分散在全部相关基因中并以低频率存在的多个SNP有关。因此,与仅靶向已知SNP的技术相比,利用从头测序策略的DNA测序技术更可能检测和/或发现这些少见的、广泛分布的变异体。传统上,通过“Sanger”法或“双脱氧”法实现DNA测序,其包括通过利用DNA聚合酶引入2,,3,-双脱氧核苷酸(ddNTP)的DNA合成的链终止(Sanger,F.,Nicklen,S.,andCoulson,.(1977)DNAsequencingwithchain-,5463-5467)所述反应还包括天然2,-脱氧核苷酸(dNTP),其通过DNA合成扩增DNA链。链扩增与链终止之间的大体平衡的竞争导致形成一系列套式DNA(nestedDNA)片段,其均勻地分布在数以千计的碱基中并且在碱基对增长尺寸方面不同。利用电泳根据套式DN***段的各自尺寸对其进行拆分。测序反应中的dNTP/ddNTP比决定链终止的频率,并因此决定终止链的长度分布。然后,当利用合适的激光源照射时,通过之
前的4种不同荧光团与4种DNA碱基(即A、C、G和T)的结合发出其各自颜色的荧光来检测所述片段。目前,Srnger测序通过直接PCR测序(Gibbs,·,Nguyen,P.-N.,McBride,LJ.,Koepf,.,andCaskey,.(1989)IdentificationofmutationsleadingtotheLesch-,1919-1923)或基因组测序(Hunkapiller,Τ.,Kaiser,.,Koop,.,andHood,L.(1991)Large-,59—67;.(2001)Nature409,860-921)已经成为用于发现SNP的最广泛应用的方法。另一种具有前景的测序方法是周期可逆终止(CRT),其为一种测多模板的同步单个碱基加成的周期性方法。该方法本身与Sanger法(Metzker,.(2005)GenomeRex15,1767-1776)的不同之处在于其可不需要凝胶电泳(其为推进该领域的主要瓶颈)而进行。然而,与Sanger测序相似,读取长度较长意味着需要较少次测序试验来覆盖整个基因组。仍然难于实现长CRT读取的目标,因为利用可商购的DNA聚合酶,可逆的终止子通常起到弱底物的作用。利用3’-0_阻滞基团和通过连接基团与荧光染料结合的核碱基构成可逆的终止子。在随后的
碱基加成之前,阻滞基团和染色基团均需要除去。这些核苷酸修饰不能良好地耐受DNA聚合酶,这可通过多种策略进行突变来提高酶性能。脱保护时,将核碱基连接物置于一边,随着其后的CRT循环,在生长中的DNA双螺旋中进行依次累积。据信弱的酶动力学和随后修饰的DNA双螺旋限制了较长的读取长度。本发明部分地描述了需要终止部分和荧光染色部分的单一结合来提高酶动力学和脱保护效率的新的可逆核苷酸结构。这些可逆终止子通过多种可商购的DNA聚合酶而被有效地引入,所述生长中的DNA双螺旋通过脱保护步骤转变为其天然状态。CRT技术的DNA测序读取长度由每个核苷酸加成循环的总效率所决定。例如,如果认为50%原始材料的终点具有可接受的信噪比,那么下述等式可用于评价循环效率对读取长度的作用(RL广eff=,其中RL是碱基的读取长度,CefT是总循环效率。换句话说,可以通过90%的总循环效率实现7个碱基的读取长度,通过99%的循环效率实现70个碱基的读取长度,%循环效率实现700个碱基的读取长度。为实现对大长度测序的目标,所述方法必须提供非常高的循环效率或者所述恢复可降至可接受的信噪比以下。表现出较高引入效率和脱保护效率的可逆终止子将实现较高的循环效率,因而实现较大的读取长度。为使CRT终止子适当地起作用,必须在温和条件下有效地断裂掉所述保护基。保护基的除去通常涉及利用强酸或强碱、催化或化学还原的处理,或者这些方法的组合。这些条件对于所述
DNA聚合酶、核苷酸、寡核苷酸引物模板、或固体载体而言可能是反应活性的,产生不希望的结果。使用光化学保护基是一种有吸引力的替代强烈化学处理的方法,并且可以非侵入方式进行使用。已有多种光可除去的保护基(例如2-硝基苄基、苄氧基羰基、3-硝基苯基、苯甲酰***、3,5-二甲氧基苯偶姻基(3,5-dimeth0Xybenz0inyl)、2,4-二硝基苯硫基及其各自的衍生物)被用于合成肽、多糖和核苷酸(Pillai,.(1980),1-26)。在这些保护基中,光敏感的2-硝基苄基保护基已成功用于以下的基团用于二核糖核苷合成的核糖核苷的2'-0H(0htsuka,Ε.,Tanaka,,Μ·(1974)(I)Ribooligonucleotidesynthesisusingaphotosensitiveo-nitrobenzylprotectionatthe2'-,1351-1357),自动化核酶合成中的核苷亚磷酰***(ribophosphoramidite)的2,-0H(Chaulk,,.(1998)CagedRNA:photo-,3173-3178)、Affymetrix化学中用于寡核苷酸合成的亚磷酰***的
3,-OH(Pease,,Solas,D.,Sullivan,.,Cronin,.,Holmes,,.(1994)Light-,5022-5026)以及用于DNA测jSM的3’-OH(Metzker,.,Raghavacharl,R.,Richards,S.,Jacutin,.,Civitello,Α.,Burgess,,.(1994)TerminationofDNAsynthesisbynovel3'-,4259-M67)。在脱保护条件(紫外线>300nm)下,可以在不影响嘧啶或嘌呤碱基的情形下有效地断裂2-硝基苄基(Pease,,Solas,D.,Sullivan,.,Cronin,.,Holmes,
,.(1994)Light-,5022-5026)VXR(Bartholomew,
,.(1975)One-.,38)0在当今跨越不同研究部门(包括比较基因组学和进化学、法医学、流行病学、以及用于诊断和治疗的应用医学
)的应用下,对于开发新的测序技术的需求从来没有这样强烈过。对于在人序列变异研究中的广泛应用而言,目前的测序技术太昂贵、费力且耗时。基因组中心的成本是基于每1,000个(2(ι碱基的美元数来计算的,并且通常可分成仪器、人员、试剂、材料以及管理花费等类别。目前,这些中心以不到1美元/1,000个Q2tl碱基进行运作,其中至少50%的成本单独由DNA测序仪器产生。对于新的检测方法、仪器小型化、微流体分离技术的开发以及每次运行的试验数的增加将最有可能对降低成本产生最大的影响。因此,本发明的一个目的是提供可用于在高通量测序反应中对基因组信息进行有效测序的新化合物。本发明的另一个目的是提供新的试剂和试剂组合,所述新的试剂和试剂组合可以有效并可买得起的方式提供基因组信息。本发明的又一个目的是提供用于诊断方法和用于开发针对个体的靶向治疗剂的试剂的文库和阵列。
发明内容
光可断裂的标记核苷酸和核苷本发明提供了可用在DNA测序技术中的核苷化合物及其磷酸酯和盐。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的光可断裂基团。所述包含光可断裂保护基的核苷酸和核苷化合物被设计成终止DNA合成然后有效断裂,使得可以平行模式对所述核酸寡聚体进行快速测序。所述核苷酸和核苷化合物上这种利用荧光染料标记的可断裂基团的存在可提高对大的
DNA寡聚体进行平行测序的速度和准确度,以使得可进行例如对整个基因组的快速测序以及对多态性和其它有价值遗传信息的鉴定。提供了含有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物,其包含可断裂基团和/或可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。在一个实施方案中,所述核苷的碱基与2-硝基苄基共价连接,所述2-硝基苄基的α碳位置任选地被本文中所述的一个烷基或芳基取代。所述2-硝基苄基可被官能化以提高终止性能和光催化的脱保护速率。即使在核糖上的3’-OH基未被封闭时,与所述核碱基相连的2-硝基苄基或α碳被取代的2-硝基苄基的终止性能仍然存在。这些3’-OH基未封闭的终止子可良好耐受多种可商购的DNA聚合酶,这代表了优于3’-0封闭的终止子的一个关键优点。所述α碳被取代的2-硝基苄基还可被衍生化而包含所选的荧光染料。
在一个实施方案中,所述核苷的碱基与2-硝基苄基共价连接,所述2-硝基苄基任选地被本文中所述的供电子和吸电子基团中的一种或多种所取代。所述2-硝基苄基可被官能化以提高光催化脱保护的速度。所述2-硝基苄基还可被衍生化而包含可检测的荧光染料。具体而言,通过利用2-硝基苄基修饰的四种核苷三磷酸化合物和本文所述的
利用不同荧光染料标记的衍生物的组合,提供了用于DNA测序的方法,其可用于鉴别所引入的碱基以揭示作为其基础的DNA序列。标记的核苷酸和核苷还提供了可用在DNA测序技术中的核苷化合物及其磷酸酯和盐。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的不可断裂基团。所述核苷酸和核苷化合物被设计成终止DNA合成,使得可以平行模式对核酸寡聚体进行快速测序。提供了含有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物,其可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。在一个实施方案中,所述核苷的碱基与苄基共价连接,所述苄基的α碳位置任选地被本文中所述的一种烷基或芳基所取代。所述苄基可被官能化以提高终止性能。即使在核糖上的3’_0Η基未被封闭时,与核碱基相连接的任选地α碳被取代的苄基的终止性能仍然存在。这些3’-OH基未封闭的终止子可良好耐受多种可商购的DNA聚合酶,这代表了优于3’0封闭的终止子的一个关键优点。所述连接基团还可被衍生化而包含所选的荧光染料。具体而言,通过利用不可断裂的终止基团修饰的四种核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同荧光染料标记的衍生物的组合,提供了用于DNA测序的方法,其可用于鉴别所引入的碱基以揭示作为其基础的
DNA序列。
具体实施例方式光可断裂标记的核苷酸和核苷本发明提供了可用在快速DNA测序技术中的核苷酸和核苷化合物及其盐、酯和磷酸酯。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。在一个实施方案中,所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的光可断裂基团。所述核苷酸和核苷化合物包含被设计成终止DNA合成以及快速断裂的光可移除保护基,使得这些单体可用于以平行模式快速测序。所述核苷酸和核苷化合物上这种利用荧光染料标记的可快速断裂基团的存在可提高大的DNA寡聚体的平行测序的速度和准确度,以使得可以例如对整个基因组进行快速测序以及鉴定多态性和其它有价值的遗传信息。提供了包含核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物,其包含可断裂基团和/或可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。在一个实施方案中,所述核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物可与光可除去的保护基如2-硝基苄基共价连接。所述2-硝基苄基可被衍生化以提高其对DNA合成的终止以及脱保护速度,因此增强了其在DNA测序中的用途。还可利用荧光染料通过与光可除去的保护基共价连接而对所述光可除去的保护基(例如2-硝基苄基)进行衍生化。