修饰宿主dna中的对象区域的方法和选择性标记盒的制作方法.docx

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专利名称:修饰宿主dna中的对象区域的方法和选择性标记盒的制作方法
技术领域:
本发明涉及修饰宿主DNA中的对象区域的方法,并且涉及选择性标记盒。
背景技术:
在遗传工程领域,药物抗性基因已经用作人工选择转化体的工具。具体地,所需转化体可基于药物抗性基因来选择,该药物抗性基因的表达赋予耐药性。不仅药物抗性基因,而且,例如营养缺陷型基因,都用作选择转化体的工具。可用于选择转化体的这些基因通常称为选择性标记(选择性标记基因)。选择性标记基因用于选择转化体。然而,此选择性标记基因取决于其种类,对环境表现出不利的不良作用,诸如如果选择性标记基因保留在宿主细胞中,选择性标记基因对野生型微生物的生物性污染。另外,如果在同一宿主上进行多基因操作,可以使用的选择性标记基因的种类可能受到限制。因此原因,需要开发用于从转化体中去除选择性标记基因的工具。当通过从宿主基因组中删除特定区或通过将外源DNA插入至宿主细胞中而构建突变体时,也使用选择性标记基因。例如,JP-A-2007-111015公开了一种通过使用阻遏物和由该阻遏物调控的启动子
来删除宿主基因组中的特定区的方法。具体地,该方法公开了DN***断(供体DNA)通过同源重组整合进宿主基因组中,然后通过供体DNA的区域与宿主基因组的区域之间的同源重组使供体DNA和宿主基因组中的特定区均从宿主基因组删除。在此方法中,供体DNA含有选择性标记和编码阻遏物的基因,并且宿主基因组含有处于阻遏物的控制下的启动子和处于启动子的控制下的药物抗性基因。通过源自供体DNA的选择性标记可以选择其中供体DNA掺入进宿主基因组中的转化体。另外,当供体DNA整合进宿主基因组中时,宿主细胞通过阻遏药物抗性基因的表达而形成药物敏感性。供体DNA从宿主基因组中去除后,药物抗性基因的表达恢复,从而得到耐药的宿主细胞。结果,有可能使宿主基因组的特定区缺失而不将源自供体DNA的选择性标记留在宿主基因组中。如上所解释,JP-A-2007-111015的方法的有利之处在于选择性标记基因可以有效地使用。然而,该方法需要预先将表达盒引入至宿主基因组的附加步骤,所述表达盒包含处于阻遏物的控制下的启动子和在启动子的控制下表达的药物抗性基因。在克隆基因或DN***断时,难以将编码膜蛋白的基因、编码当蛋白大量存在时在宿主中起到致死因子作用的蛋白(大量蛋白的存在在宿主细胞中起到致死因子的作用)的基因、尺寸非常大的DN***断等插入至质粒中。当多种基因参与特定的生物合成或多种基
因构成亚单位时,也难以插入这些基因并且同时地在细胞中表达它们。为了克服克隆此类基因或DN***断的问题,已经提出了使用低复制质粒的方法、使用通常用于制备基因组文库的噬菌体或粘粒作为载体的方法、及类似方法。另外,也已经提出了使用可以严格地调控基因表达的启动子的方法和改善宿主大肠埃希氏菌的伴侣功能的方法。然而,改善宿主的方法经常取决于所需产物的特异性,并且需要选择和调节适于该特异性的克隆方法。在使用噬菌体或粘粒的方法中,也难以将多种基因插入至细胞的多个基因位点中。因此,存在着开发与使用噬菌体的常规方法相比以简单的步骤将多个和相对大尺寸的DN***断插入至单细胞中的方法的需求。近年来,获自环境材料的DNA通过宏基因组分析的方式进行了积极的研究。存在着对难以通过常规方法克隆的基因和DN***断进行克隆的新工具和新方法的需求。
发明内容
如上所述,用于修饰宿主DNA和获得转化体的常规遗传操作方法存在选择性标记留在转化体中的问题。JP-A-2007-111015的方法包含预先将表达盒引入至宿主基因组中的必需步骤。因此,该方法对于改善操作效率并不完全令人满意。另外,即使在特定区从宿主基因组中删除后,先前引入的表达盒仍然留在宿主基因组中。在使用质粒的常规遗传操作方法中,难以将大尺寸DN***断或致死基因引入至宿主DNA的所需区中。此外,在使用噬菌体或
粘粒的常规方法中,不可能将多个基因插入至单细胞的多个位点中。本发明要提供一种修饰宿主DNA中的对象区域的方法;其中该方法能够以简单的步骤修饰宿主DNA中的对象区域而不限制可以使用的选择性标记(选择性标记基因)的种类,并且修饰宿主DNA中的对象区域而不会在被修饰的宿主DNA中留下修饰步骤中使用的选择性标记等;并且本发明要提供一种用于该方法中的选择性标记盒。具体地,本发明要提供一种通过使宿主DNA中的所需区缺失,并且在缺失后,还不会在宿主DNA中留下选择性标记基因等来修饰宿主DNA的方法。本发明还要提供一种通过用所需的DNA序列(特别是,例如,大尺寸DN***段、难以引入至宿主中的DN***段、或多种基因(多基因))替换宿主DNA中的任何区,并且在替换后,仅留下插入至宿主DNA的所需DNA序列,而不留下选择性标记基因等来修饰宿主DNA的方法。根据本发明,提供以下方式根据本发明的修饰宿主DNA中的对象区域的方法(此后,称为本发明的修饰方法)是一种使用供体DNA修饰宿主DNA中的对象区域的方法其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的所述对象区域外侧的5'-侧区、所述宿主DNA中的所述对象区域外侧的3'-侧区和所述宿主DNA中的所述对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域,并且在与所述3'-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标
记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因;该方法包括以下步骤第一步骤,在所述5'-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组,从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体DNA整合的宿主;以及第二步骤,在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内,在源自所述宿主DNA的3'-侧区与源自所述供体DNA的3'-侧区这两个区域之间进行同源重组,从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域被修饰的宿主。根据本发明的删除宿主DNA中的用于删除的对象区域的方法(此后,称为本发明的删除方法)是一种使用供体DNA删除宿主DNA中用于删除的对象区域的方法其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的用于删除的对象区域外侧的5'-侧区、所述宿主DNA中的用于删除的对象区域外侧的3'-侧区和所述宿主DNA中的用于删除的对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域,并且在与所述3'-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因;该方法包括以下步骤第一步骤,在所述5'-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组,从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体
DNA整合的宿主;以及第二步骤,在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内,在源自所述宿主DNA的3'-侧区与源自所述供体DNA的3'-侧区这两个区域之间进行同源重组,从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域删除的宿主。根据本发明的替换宿主DNA中的用于替换的对象区域的方法(此后,称为本发明的替换方法)是一种使用供体DNA替换宿主DNA中用于替换的对象区域的方法其中所述供体DNA依序包括分别与所述宿主DNA中的用于替换的对象区域外侧的5'-侧区、所述宿主DNA中的用于替换的对象区域外侧的3'-侧区和所述宿主DNA中的用于替换的对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域,包括与所述5'-侧区同源的区域和与所述3'_侧区同源的区域之间的所需DNA序列,并且在与所述3'-侧区同源的区域和与所述第一同源重组区同源的区域之间还包括第一选择性标记基因、表达诱导启动子和在所述表达诱导启动子的控制下表达的第二选择性标记基因;该方法包括以下步骤第一步骤,在所述5'-侧区和所述第一同源重组区的区域处进行所述供体DNA和所述宿主DNA之间的同源重组,从而基于所述第一选择性标记基因的表达选择与所述供体DNA整合的宿主;以及第二步骤,在通过所述第一步骤与所述供体DNA整合的所述宿主DNA内,在源自所
述宿主DNA的3'-侧区与源自所述供体DNA的3'-侧区这两个区域之间进行同源重组,从而在所述表达诱导启动子的表达诱导条件下基于所述第二选择性标记基因的表达选择其对象区域被所需DNA序列替换的宿主。在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中,可通过例如,正向选择(positiveselection)来进行基于第二选择性标记基因的表达的第二步骤中的宿主选择。此后,其对象区域被修饰的宿主、其对象区域删除的宿主或其对象区域被所需的DNA序列替换的宿主将简单地称为“转化体”或“突变体”。在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中,第二选择性标记基因不特别地限制,但可以是,例如,编码诱导宿主细胞死亡的蛋白的基因。编码诱导宿主细胞死亡的蛋白的基因不特别地限制,但可以是,例如,ChM基因。在这种情况下,通过第二步骤从宿主DNA中删除源自供体DNA的选择性标记基因的宿主可以增殖。另一方面,含有保留了源自供体DNA的选择性标记基因的基因组的宿主在表达诱导条件下不能增殖。正向选择允许选择不含有源自供体DNA的选择性标记基因的宿主。在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中,表达诱导启动子不特别地限制,但可以是在表达诱导物的存在下诱导下游基因的表达的启动子。此外,在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中,第一选择性标记基因不特别地限制,但可以是,例如,药物抗性基因。具体地,有可能防止选择性标记基因留在宿主
DNA中,因为根据本发明的修饰方法、删除方法和替换方法,选择性标记基因从宿主DNA中除去。此外,在本发明的修饰方法、删除方法和替换方法中,可以使用的宿主的种类不特别地限制,但例如,可以是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。用于本发明中的选择性标记盒具有第一选择性标记基因、诱导表达启动子和在表达诱导启动子下表达的第二选择性标记基因。在供体DNA中,选择性标记盒位于与对象区域外侧的3'-侧区同源的区域和与对象区域内侧的第一同源重组区同源的区域之间。第二选择性标记基因优选地编码诱导宿主细胞死亡的蛋白。具体地,ChM基因优选地用作第二选择性标记基因。表达诱导启动子优选是在表达诱导物的存在下诱导下游基因表达的启动子。作为第一选择性标记基因,可以优选地使用药物抗性基因。根据本发明的选择性标记盒可以处于掺入在枯草芽孢杆菌基因组中的状态。此外,本发明要提供一种产生通过上述本发明的修饰方法、删除方法和替换方法修饰对象区域的宿主的方法。根据本发明的方法,有可能以简单的步骤修饰宿主DNA中的所需区域。根据本发明,在修饰过程(包括删除过程和替换过程)中使用的第一选择性标记基因或第二选择性标记基因在修饰后均不保留于宿主DNA中。因此,有可能制备所需的转化体而不限制可以使用的选择性标记基因的范围。特别是当修饰宿主DNA中的多个区域时,与选择性标记基因保留在宿主中的常规基因修饰方法相比,根据本发明的修饰过程可
以大大简化,因为可以使用任意的选择性标记基因而没有限制。除了选择性标记基因以外,根据本发明,修饰过程中使用的其他区域(诸如第一同源重组区、启动子序列等)在修饰后不保留在宿主DNA中。因此,当在同一宿主中反复地进行多次修饰时,根据本发明的修饰过程也可以简化。根据本发明,还有可能防止由选择性标记基因残留在宿主中所导致的对环境的不良作用。例如,如果药物抗性基因携带在致病株(即,耐药微生物)中,则存在关于环境污染的问题。引入药物抗性基因的菌株通常作为重组生物体处理,并且其需要防止菌株传播至环境中。因此,使用此类菌株的操作步骤更为复杂,诸如限制了菌株的生产、使用和储藏中的处理,并且需要防止菌株的扩散。本发明有效地用于由残留选择性标记基因所导致的此类环境污染。此外,根据本发明,用于修饰的对象区域不限于宿主DNA中的特定位置,并且宿主DNA中的任何区域可作为用于修饰的对象区域进行修饰。
此外,根据本发明,宿主DNA中的较宽区域可用作用于修饰的对象区域。更具体地,宿主DNA中的较宽区域可被删除或替换。
[图1]图1是显示根据本发明的删除宿主DNA中的对象区域的方法的一个实施方式的流程图。[图2]图2是显示根据本发明的替换宿主
DNA中的对象区域的方法的一个实施方式的流程图。[图3]图3是显示使用SOE-PCR片段通过双交换法(doublecrossovermethod)引入药物抗性基因的过程的流程图。[图4]图4是显示作为根据本发明的修饰宿主DNA中的对象区域的方法的一个实施方式,将所需DNA序列插入至引入了药物抗性基因的宿主DNA中的过程的流程图。[图5]图5是显示制备实施例1和2中使用的Bacillussubtilis168(aprEspec,IacI,Pspac-chpA)禾口Baci1Iussubtilis168(aprEKm,IacI,Pspac-chpA)的过程的流程图。[图6]图6是显示实施例1中从宿主DNA中删除对象区域的过程的流程图。[图7]图7是显示实施例2中将DNA序列插入至宿主DNA中的过程的流程图。从下面的描述,适当地参考附图,将更充分地显示本发明的其他和进一步的特征和优点。
具体实施例方式此后,本发明将参考附图详细地说明。在本发明中,术语“修饰宿主DNA中的对象区域”是指宿主DNA中的对象区域的DNA序列被改变或修饰。具体地,其是指对象区域的DNA序列从宿主DNA中删除,或宿主DNA中的对象区域的DNA序列被所需的DNA序列替换以便将所需的DNA序列插入至宿主DNA中。因此,本发明的修饰方法包括本发明的删除方法和本发明的替换方法作为优选的实施方式。此后,在本说明书中,包括本发明的删除方法和替换方法的本发明的修饰方法简单地称为“本发明”或“本发明的方法”。本发明的删除宿主