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使用孔和Hel308解旋酶表征目标多核苷酸的酶方法
本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法使用孔和Hel308解旋酶或能结合目标多核苷酸内部核苷酸的分子马达。所述解旋酶或分子马达控制目标多核苷酸穿过所述孔的运动。
【专利说明】使用孔和Hel308解旋酶表征目标多核苷酸的酶方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法使用孔和Hel308解旋酶或能结合目标多核苷酸内部核苷酸的分子马达。所述解旋酶或分子马达控制目标多核苷酸穿过所述孔的运动。
【背景技术】
[0002]当前,需要适用于各种应用的快速且便宜的多核苷酸(即DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵,主要是由于它们依赖于扩增技术产生大量的多核苷酸并需要大量的专业荧光化学品进行信号检测。
[0003]跨膜孔(纳米孔)具有极大潜力作为聚合物和许多小分子的直接的,电生物传感器。特别是最近的聚焦点是将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。
[0004]穿过纳米孔施加电势时,当分析物诸如核苷酸短暂停留在桶内一段时间将会有电流的变化。核苷酸的纳米孔检测给出已知标记和时间的电流变化。在
“链测序(StrandSequencing)”方法中,使单个多核苷酸链穿过所述孔并获得对各核苷酸的鉴定。链测序可涉及使用核苷酸调控蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的运动。
【发明内容】
[0005]本发明人已经证明Hel308解旋酶能够控制多核苷酸穿过孔的运动尤其当在施加电势诸如电压时。所述解旋酶能使目标多核苷酸以可控和逐步的方式逆着或顺着由所施加的电压引起的电场进行运动。令人惊奇地,所述解旋酶能在高的盐浓度下起作用,这对于表征多核苷酸,尤其是使用链测序的方法确定多核苷酸的序列,是有利的。这将在下文进一步详细描述。
[0006]相应的,本发明提供一种表征目标多核苷酸的方法,包括:
[0007](a)将所述目标多核苷酸与跨膜孔和Hel308解旋酶接触,使得所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔运动,并使所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用;以及
[0008](b)在一次或多次相互作用中测定目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
[0009]本发明还提供了:
[0010]-一种用于表征目标多核苷酸的传感器的形成方法,包括在孔和
Hel308解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器;
[0011]-ΗΘ1308解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用;
[0012]-一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒,包括(a)孔和(b)Hel308解旋酶;以及
[0013]-一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析设备,包括多个孔和多个Hel308解旋酶。
[0014]本发明人还证明了分子马达能结合目标多核苷酸的内部核苷酸并能控制目标多核苷酸穿过孔的运动尤其当在该孔施加电势诸如电压时。所述分子马达能使目标多核苷酸以可控和逐步的方式逆着或顺着由所施加的电压引起的电场运动。令人惊奇的是,在本发明方法中使用分子马达时,可以控制目标多核苷酸整条链穿过纳米孔的运动。这对于多核苷酸的表征,尤其是使用链测序的方法确定多核苷酸的序列,是有利的。
[0015]因此,本发明还提供一种表征目标多核苷酸的方法,包括:
[0016](a)将所述目标多核苷酸与跨膜孔和能结合该目标多核苷酸的内部核苷酸的分子马达接触,使得所述分子马达控制目标多核苷酸穿过所述孔的运动,并使所述目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用;以及
[0017](b)在一次或多次相互作用中测定目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1。a)使用解旋酶控制DNA穿过纳米孔的运动的例示图。I)将ssDNA底物(a)与含有胆固醇标签(c)的退火引物(b)添加到双分子层(d)的顺侧。胆固醇标签结合到所述双分子层上,在双分子层上富集所述底物。2)添加到顺式隔间(compartment)的解旋酶Ce)连接到DNA上。在二价金属离子和NTP底物的存在下,所述解旋酶沿着所述DNA运动。3)在施加的电压下,通过DNA上的前导区部分纳米孔(f)捕获所述DNA底物。在施加的电势的力的作用下,所述DNA被牵拉穿过所述孔直到连接在DNA上的解旋酶与所述孔的顶部接触,防止进一步的不受控的DNA移位。在该过程中dsDNA部分(诸如引物)被去除。所述解旋酶沿着所述DNA以3’到5’的方向运动,以逆着所施加的电场将螺旋状(threaded)DNA牵拉出所述孔。4)解旋酶将所述DNA牵拉出所述纳米孔,将其供回到所述顺式隔间。穿过所述纳米孔的DNA的最后部分为所述5’-前导区。5)当所述解旋酶将所述DNA移出所述纳米孔后,其释放回所述顺式隔间中。b)实施例中使用的DNA底物的设计(a=具有50T前导区(b)的400merDNA链,C=引物,d=胆固醇标签)。
[0019]图2是解旋酶能以可控方式移动DNA穿过纳米孔,随着DNA穿过纳米孔的运动产生逐步变化的电流。解旋酶-DNA事件(在上部分图以小箭头标明)的例子(180mV,400mMKCl,,,10nMHel308Mbu,ImMDTT,ImMATP,ImMMgCl2)。上部),获得Hel308400merDNA事件的电流(y轴,pA)(x轴,s)的分图。所述开孔(open-pore)电流为~180pA(标为A)。DNA在施加的电势(+180mV)的力的作用下被所述纳米孔捕获。具有酶连接的DNA产生长的模块(block)(在该条件下,在~60pA),随着酶移动DNA穿过所述孔,该模块显示出逐步变化的电流。中部)该中间的分图(middlesect1n)是DNA事件(I)中的一个的放大图,显示DNA-酶的捕获,随着DNA被牵拉出所述孔时电流的逐步变化,并在出所述纳米孔之前以特征性的长PolyT水平结尾。下部),随着DNA移动穿过所述纳米孔电流逐步变化的放大图。
[0020]图3是解旋酶控制的DNA运动产生与DNA穿过所述纳米孔时一致的电流变化模式(图3a和3b中,y轴=电流(pA),x轴时间(s))。来自四个典型DNA事件的最后~80的电流变化例子以PolyT水平而结尾。这四个例子(两个在3a中,两个在3b中)表明观察到一致的电流变化模式。
[0021]图4是提高的盐浓度提高了孔电流并产生更大的DNA分辨范围(范围=覆盖DNA电流变化的最小电流到最大电流)。在
400mM,1M,和2MKCl下,解旋酶-DNA事件的例子示于图4和图4c(图4a至4c中,180mV,,:59和60,10nMHel308Mbu,ImMDTT,ImMATP,ImMMgCl2)。上部的轨迹(traces)显示了以polyT水平结尾的完整事件(通过A用1-开口标出),下面的轨迹显示了每个事件的最后10秒的急速上升部分,具有150pA的恒定j轴电流大小。盐浓度由400mMKCl提高到2MKCl导致开口电流提高了~350%((1-开口由~180pA到~850pA)),以及分辨范围提高了~200%(~25pA到~75pA)。图4d是DNA分辨范围随盐浓度变化的图(y轴=范围(pA),x轴=盐(mM))。
[0022]图5是解旋酶(a)以至少两种操作模式控制DNA的移动。所述解旋酶沿着DNA以3’_5’的方向移动,但在纳米孔(c)中的DNA的方向(依赖于DNA的哪一端被捕获)意味着所述酶可以用于将DNA逆着施加的电场移出所述纳米孔(图5b),或者顺着施加的电场移进所述纳米孔(图5a)。图5b),当DNA的5’端被捕获时,解旋酶逆着通过电压施加的电场的方向工作,将DNA牵拉出所述纳米孔直到DNA被释放回所述顺室。右边是He1308逆着施加的电场沿着5’端向下运动得到的DNA-解旋酶事件的实例。图5a),当DNA在3’向下被所述纳米孔捕获时,所述酶将DNA顺着电场的方向移进所述纳米孔,直到其完全穿过所述孔移位,并释放在所述双分子层的反侧。右边是来自
Hel308沿3’顺着施加的电场向下运动得到的DNA-解旋酶事件的实例(y轴=电流(pA),x轴=时间(S))。电流的轨迹在DNA的5’向下或3’向下的方向之间变化。[0023]图6是检测酶活性的荧光分析。a)使用常规的荧光底物检测解旋酶(a)用于置换杂交的dsDNA的能力。I)所述荧光底物链(终浓度10nM)具有3’ssDNA突出部分,以及杂交的dsDNA的40个碱基部分。主链上部(b)(Themajorupperstrand)在5’末端具有羧基突光素碱基(c),并且所述杂交的互补链(d)在3’末端具有黑洞淬灭剂(black-holequencher(BHQ-1))碱基(e)。当杂交时,来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭,所述底物基本上是无荧光的。所述分析中还包括,与荧光底物的较短链(d)互补的IμΜ的捕获链(f)。2),在ATP(ImM)和MgCl2(5mM)存在下,添加到所述底物中的解旋酶(10nM)连接到所述荧光底物的3’尾部,沿着所述主链移动,并如图所示置换所述互补链。3),再次地(once)具有BHQ-1的互补链完全取代主链荧光上的荧光素。4),过量的捕获链优先与互补链DNA退火以防止初始底物重新退火与丢失荧光。b)含有400mM到2M不同浓度的KCl(x轴,mM)的缓冲液(,ImMATP,5mMMgCl2,10nM荧光底物DNA,IμM捕获DNA)的初始活性(y轴,相对活性)速率的图。
[0024]图7显示了解旋酶控制的DNA事件的实例,使用了不同的
He1308解旋酶(图7a_7c中,y轴=电流(pA),X轴=时间(min),180mV,,:59和SEQIDNO:60,10nMHel308,ImMDTT,ImMATP,ImMMgCl2):He1308Mhu(a),He1308Mok(b)和Hel308Mma(c)。这些DNA事件代表了典型的DNA穿过MspA纳米孔的受控运动(WpolyT水平结尾)的实例。
[0025]图8是测试解旋酶内部连接活性的荧光分析。A)使用常规的荧光底物分析解旋酶连接到缺少天然3’末端的DNA的能力,使得它们能随后置换杂交的dsDNA。所述荧光底物链(终浓度50nM)具有3’ssDNA突出部分,以及杂交的dsDNA的40个碱基部分。主链上部(a)用4个连续的非DNA起源的三甘醇间隔物(称为“间隔9”基团,标记为b)修饰,在3’端或者在内部,在突出部分和dsDNA的连接处(作为阴性对照)进行修饰。进一步的,所述主链在5’端具有羧基荧光素碱基(C),并且所述杂交的互补链(d)在3’端具有黑洞淬灭剂(BHQ-1)碱基(e)。当杂交时,来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭,所述底物基本上是无荧光的。所述分析中还包括,与荧光底物的较短链(d)互补的捕获链(ΙμΜ,?.)。B),在ATP(ImM)和MgCl2(ImM)存在下,添加到含3’末端的“间隔9”基团的所述底物中的Hel308解旋酶同源物(20nM)能连接到所述荧光底物的ssDNA突出部分,沿着所述主链移动,并置换所述互补链。C),再次地,具有BHQ-1的互补链完全取代主链荧光上的荧光素。
D)过量的捕获链优先退火到互补链DNA以防止初始底物重新退火与丢失荧光。
[0026]图9显不了He1308-介导的dsDNA转换(turnover)的相对速率,在400mMNaCl,1mMHepes,,ImMATP,ImMMgCl2,50nM荧光底物DNA,IμM捕获DNA中比较3’-未修饰的DNA和3’-“间隔9”DNA(y轴=3’-“间隔9”的相对活性(天然3’的重量%),X轴=a(Mbu),b(Csy),c(Tga),d(Mma),e(Mhu),f(Min),g(Mig),h(Mmaz),i(Mac),j(Μok),k(Mth),I(Mba),m(Mzh))。
[0027]图10是使用解旋酶控制DNA穿过实施例5中所使用的纳米孔进行运动的示意图。A)具有退火引物(SEQIDN069)(标记的y)的DNA底物(SEQIDNO:67(标记的w)和SEQIDNO:68(标记的X))被添加到所述双分子层顺侧,所述引物具有连接的胆固醇标签。胆固醇标签结合到所述双分子层,使得底物在所述双分子层表面富集。添加到所述顺式隔间的解旋酶(标记的I)连接到SEQIDN067的4bp前导区。B)在施加的电压下,所述DNA底物经DNA上的5’前导区被所述纳米孔捕获,脱去SEQIDN069。C)在施加的电场的力的作用下,DNA被牵拉进所述孔,直到所结合的解旋酶(I)接触所述孔的顶部并防止进一步的不受控的移位。在该过程中,所述反义链SEQIDN068从所述DNA链上脱离。D)在二价金属离子和NTP底物存在下,在所述孔顶部的所述解旋酶(I)沿着所述
DNA移动并控制DNA穿过所述孔的移位。所述解旋酶沿着所述DNA以3’到5’的方向移动,逆着施加的电场的方向将螺旋状DNA从所述孔牵拉出。顺侧(在此情况下为3’)上暴露的单链DNA可以被另外的解旋酶(2-4个)连接,在末端核苷酸或是在内部核苷酸连接。E)如果在所述孔(I)的解旋酶从DNA脱离,所述DNA在电场作用下被牵拉到所述孔中直到下一个在DNA上的解旋酶(2)到达所述孔。在所述孔处的解旋酶将所述DNA牵拉出所述纳米孔,将其供回到所述顺式隔间。DNA最后穿过所述纳米孔的部分是5’-前导区。F)当解旋酶将DNA移出所述纳米孔时,其释放回所述顺式隔间。箭头指示了DNA运动的方向。
[0028]图11显示了在每个解旋酶事件中,随着Hel308解旋酶同源物Mbu控制DNA链穿过所述MspA孔的移位(X-轴),在900mer的纳米孔中DNA区域的位置(y_轴)变化的数据图(y轴=在900mer中的位置,x轴=指数)。A-C显示了大约从DNA链的开头到DNA链的结尾(通过polyT前导区结束(exitingviapolyTleader))整条DNA链的典型移位事件的实例,而事件D是不完全的DNA移位的实例,其中酶的脱离意味着DNA不曾使该酶到达该DNA链的末端。滑动(例如,由虚线圆圈强调的大的滑动)表明序列由于酶的脱离,落回到链上之前的点。当酶脱离时,DNA将在电场力的作用下被牵拉回纳米孔,直到另一个酶进一步沿着所述链接触所述孔,然后继续进行解旋酶的运动。