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专利名称::使用具有被打断的葡糖脱氢酶基因(gms01)的微生物来生产生物质的工艺的制作方法使用具有被打断的葡糖脱氢酶基因(GMS01)的微生物来生产生物质的工艺本发明涉及经遗传工程改造的微生物,其被改造来增加从碳源(例如葡萄糖)生产生物质(biomass)的产率和效率。本发明还提供了产生此类微生物的方法。本发明还涉及包含下述基因的多核苷酸序列,所述基因编码涉及碳源生物转化,例如葡萄糖向生物质的生物转化的蛋白质。本发明还涉及包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段,所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段,以及它们的功能等同物。本发明还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法,由此产生具有降低的碳源转移(diversion)的微生物,即从碳源(例如葡萄糖)进行的生物质生产的产率和/或效率更高。碳源的生物转化可能涉及很多不同代谢途径,以及涉及若干酶促步骤,以产生生物质,其中,酶可位于宿主细胞的胞质溶胶中、膜上或周质空间中。此外,转运蛋白也可能在碳源向生物质的高效转化中具有重要作用。例如,在乙酸细菌(其是专性需氧的革兰氏阴性微生物,属于Jcetotecter、G7t/cowoZacter禾口G7wcowaceto6ac,er属)的情况下,这些微生物能通过与膜结合的
D-葡糖脱氢酶在周质膜水平上将D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸盐/酯,并将D-葡萄糖酸盐/酯转运进胞质溶胶。然后通过葡萄糖酸激酶将D-葡萄糖酸盐/酯磷酸化为D-葡萄糖酸盐/酯-6-磷酸盐/酯。除此之外,人们相信,D-葡萄糖可被直接转运进胞质溶胶,然后通过胞质溶胶中的NAD(P)-依赖性D-葡萄糖脱氢酶将其转化为D-葡萄糖酸盐/酯。此外,转运进胞质溶胶的D-葡萄糖还可先被磷酸化为D-葡萄糖-6-磷酸盐/酯,然后再被脱氢成D-葡萄糖酸盐/酯-6-磷酸盐/酯。0-葡萄糖酸盐/酯-6-磷酸盐/酯可进入磷酸戊糖途径,其被进一步代谢,产生以NAD(P)H形式存在的还原能量和生长及维持所必需的三羧基化合物。在葡萄糖代谢中具有活性的蛋白质,尤其是酶,在本文中被称为涉及葡萄糖代谢系统(QlucoseMetabolizationSystem)。此类蛋白质在本文中被縮写为GMS蛋白,其在碳源(例如葡萄糖)向生物质的直接代谢或生物转化中发挥作用。但是,此类生物转化的一个缺点在于,碳源或中间产物通过所述生物转化过程转移,使得,例如,下一个(酶促)步骤不能以最优方式进行,导致损失了可获得的用于向生物质的转化的碳底物材料,以及由此导致的能量(以例如ATP或NADPH的形式存在)损失。在例如葡萄糖向生物质的生物转化的情况下,该损失可能是由于将葡萄糖或其中间产物转运出胞质溶胶导致的,或者是使用葡萄糖或得到的中间产物作为不导致产牛生物质的其它途径的底物而导致的。本发明的一个目的是提供被改造的微生物,是以下述方式对其进行改造的,所述方式使得经过碳源
(例如葡萄糖)的生物转化的碳源转移被改变,例如,通过降低碳源转移,从而从此类碳源生产更高产量和/或产率的生物质。令人吃惊地,现己发现,GMS蛋白或此类蛋白的具有针对或涉及碳源(例如,葡萄糖)生物转化的活性的亚基在对生物质的生产中具有重要作用。在一种实施方式中,本发明的GMS蛋白选自氧化还原酶[ECl],优选选自在供体的CH-OH上发挥作用的氧化还原酶[],更优选选自用NAD+或NADP+作为受体的氧化还原酶[ECl丄l]以及具有醌或类似化合物受体的氧化还原酶[EC1丄5],最优选是NADP依赖性葡糖脱氢酶[]和PQQ依赖性葡糖脱氢酶[],或者,本发明的GMS蛋白选自转移酶[EC2],优选地,转移含磷基团的转移酶[],更优选地,具有醇基团受体的磷酸转移酶[],最优选地,葡萄糖酸激酶[]。此外,GMS蛋白或此类蛋白的具有针对或涉及碳源(例如,葡萄糖)向生物质的生物转化的活性的亚基可选自与膜结合的PQQ依赖性D-葡糖脱氢酶,NAD(P)-依赖性D-葡糖脱氢酶,胞质D-葡糖激酶,具有针对或涉及D-葡萄糖酸盐/酯同化的活性的酶或酶亚基,例如与膜结合的FAD依赖性D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶(形成2-***基-D-葡萄糖酸盐/酯),与膜结合的PQQ依赖性D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶(形成5-
***基-D-葡萄糖酸盐/S旨),胞质D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶,具有针对或涉及2KD同化的活性的酶或酶亚基,例如与膜结合的FAD依赖性2-***基-D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶,NAD(P)-依赖性葡糖-l-脱氢酶,含核黄素的葡萄糖酸盐/酯-2-脱氢酶,葡萄糖酸盐/酯-5-脱氢酶(5-***基-D-葡萄糖酸盐/酯还原酶)和胞质NAD(P)-依赖性2-***基-D-葡萄糖酸盐/酯脱氢酶构成的组。特别地,现已发现,具有下述核苷酸序列的多核苷酸编码的GMS蛋白在碳源(例如,葡萄糖)向生物质的生物转化中具有重要作用,该核苷酸序列能在优选高度严谨条件下与SEQIDNO:1所示的序列杂交。现还已发现,通过在微生物(例如G/"co"oZw"er)中对根据本发明的此类核苷酸进行遗传改变,可很大程度地提高所述微生物所述生物转化的的效率,导致,例如,从碳源(例如,葡萄糖)到生物质的更高的产量和/或产率。随后,本发明涉及选自下述组的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链,所述组由(a)编码包含根据SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸;(b)包含根据SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸;(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸,所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板,并使用根据SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物组,通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得;(d)多核苷酸,其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列,其中,在所述衍生物中,一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代,并且,所述片段或衍生物具有氧化还原酶
[ECl],优选在供体的CH-OH上发挥作用的氧化还原酶[](GMS01)的活性;(e)编码氧化还原酶[ECl],优选在供体的CH-OH上发挥作用的氧化还原酶[](GMS01)的多核苷酸,其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸互补;以及(f)编码氧化还原酶[ECl],优选在供体的CH-OH上发挥作用的氧化还原酶[](GMS01)的多核苷酸,其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70%相同,例如85%、90%或95%相同;构成。我们发现,本文中描述的SEQIDNO:2示出的从G/wcwzotecter0x_y&MDSM17078分离的GMS蛋白是特别有用的GMS蛋白,因为编码所述GMS蛋白的基因看起来在微生物(特别是细菌,例如乙酸细菌,例如G7wcowc^acter,Jceto6acter禾口G7wcowaceto6acte;0中碳源(例如葡萄糖)向生物质的生物转化中发挥关键作用。因此,本发明涉及编码根据SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸。该蛋白可由SEQIDNO:1示出的核苷酸序列编码。本发明因此还涉及包含根据SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸。上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为"查询序列",以便用来自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)针对数据库PROSW-SwissProt(完全发布版本加上增加的更新)进行搜索。根据这些搜索结果,将根据
SEQIDNO:1的GMS01多核苷酸标注为编码具有与膜结合的PQQ-依赖性葡糖脱氢酶活性的蛋白。可使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板,使用合适的寡核苷酸引物(例如根据SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的核苷酸引物),按照标准PCR扩增技术,通过核酸扩增来获得根据本发明的核酸。由此扩增出的核酸可被克隆进合适的载体,并通过DNA序列分析对其进行表征。用于反应的模板可以是通过对从已知包含或怀疑包含根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆和测序,以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通过多种已知方法,用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如,可标记扩增出的片段,用其筛选噬菌体或粘粒(cosmid)cDNA文库。或者,经标记的片段可用于筛选基因组文库。因此,本发明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸,所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板,并使用根据SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物组,通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得。本发明还涉及下述多核苷酸,其包含编码本文所述的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列,其中,在所述衍生物中,一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代,并且,所述片段或衍生物具有GMS多肽(优选地,GMS01多肽)的活性。本发明还涉及下述多核苷酸,其编码GMS多肽(优选地,GMS01多肽),其互补链能在严谨条件下与本文定义的多核苷酸互补。本发明还涉及下述多核苷酸,其与本文定义的多核苷酸至少
70%相同,并且其编码GMS多肽;本发明还涉及是上文定义的多核苷酸的互补链的多核苷酸。本发明还涉及可用于扩增或探测根据本发明的DNA以及用于鉴定也携带此类基因的相关微生物种或科的引物、探针和片段。本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体和用所述多核苷酸或所述载体遗传工程改造过的微生物。本发明还涉及生产能表达上文定义的多核苷酸编码的多肽的微生物和上文定义的多核苷酸编码的多肽的工艺。本发明还涉及下述微生物,其中,GMS多肽(优选地,GMS01多肽)的活性降低或消失,使得从通过从碳源(例如葡萄糖)的生物转化生产的生物质的产率和/或产量增加。可转化为生物质的合适碳源可以例如是葡萄糖或选自下述碳源,所述碳源的同化导致葡萄糖(特别是D-葡萄糖)形成,它们例如是蔗糖、麦芽糖、淀粉、纤维素、纤维二糖、乳糖、异麦芽糖、葡聚糖、海藻糖或其混合物。技术人员将知道如何使GMS蛋白(优选地,GMS01蛋白)的活性降低或消失。这例如可以通过使GMS蛋白(优选地,GMS01蛋白)的比活性减少或消失来完成,或者通过对宿主生物进行遗传修饰来完成,所述遗传修饰以较之野生型生物产生更少或不产生GMS蛋白(优选地,GMS01蛋白)的拷贝的方式来进行。在下述说明书中,将对达到此目的(即,通过使GMS01蛋白的活性降低或消失,
增加通过从碳源(例如葡萄糖)的生物转化生产的生物质的产率和/或产量)的方案进行详细描述。在进行必要修正后,这些方案可应用于其它GMS蛋白。为获得产生更少拷贝的或不产生GMS01基因和/或蛋白的生物所进行的修饰包括使用弱启动子,或者对GMS01基因(的部分)或其调控兀件加以突变(例如,插入、缺失或点突变)。使GMS01蛋白比活性降低或消失也可通过本领域已知的方法来完成。此类方法可包括对GMS01基因(的部分)的突变(例如,插入、缺失或点突变)。本领域中还已知可以通过将GMS01蛋白与特定抑制剂相接触或与能与GMS01蛋白发生特异性相互作用的其它物质相接触,来使给定蛋白质活性降低或消失。为鉴定出此类特定抑制剂,可表达GMS01蛋白,并对存在怀疑能抑制GMS01蛋白活性的化合物时的活性加以测试。可能的抑制用化合物可例如是针对GMS01蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。此类抗体可通过对合适的实验动物进行常规免疫方案来获得。本发明可以在携带有GMS01基因或其同源体的任何微生物中进行。合适的微生物可选自酵母、藻类和细菌构成的组,它们可以是野生型菌株或通过标准的诱变方法和选择方法获得的突变体菌株以及重组菌株。此类酵母的例子可以是,例如,Oz"^Wfl、5^cc/^ramj;ce5、Zygasacc/wra附7ces、Sc/n'zosacc/zaramyc"或A7w_yveram_yces。此类藻类的例子可以是,例如,CWo"//a。此类细菌的例子可以是,例如,
G7wcowoZ)ac欣、Jceto6a"e/-、G7wcowaceto6acter、《etogw/om'c(g^、尸awtoea、尸化i^omowcw(例如,尸sei^/omow"5j9M^/a)'a(例如￡^cAe"'c/'acoz7)。优选的是G7wcowoZacter或爿ceto^ac,eracW,例如,;^ms、(、、」.swfo/.xWw謂或A5wfo/.or/eam^,优选地,;^wsDSM17078。已按照《布达佩斯条约》,于2005年1月26日将G/wco"okzcterox_yc/aMDSM17078(以前称作G7wcowoiac/eroxj^aiwN44-l){呆藏至DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany。可用于本发明的微生物可被公众从不同来源获得,例如,DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany、AmericanTypeCultureCollection(ATCC),,Manassas,VA20108USA或CultureCollectionDivision,NITEBiologicalResourceCenter,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan(以前是InstitueforFermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome,Yodogawa-ku,Osaka532-8686,Japan)。保存到IFO的优选的细菌的例子例如是
G/MCO"o6acterox;^fl^(^)IF03293、G7wcowo6a"eroxj/t/aws()IF03292、G7wcowoZactero砂c/朋s((g7'/mms1)IF03244、G7wccwo6acter/rate訓7(以前被禾尔为G./miiM",r^)IFO3260、G7wcowo6actercer/wwsIF03266、G7wcowo6acteroxyfifewIFO3287和爿ce/oZwc/wac"/oWea"wIFO3259,上述这些都于1954年4月5日被保藏;1975年10月22日保藏的Jcetokzcter.—>2謂IFO13693禾卩1977年12月8日保藏的爿cetokcterace"wfe/.x_y/z>wmIFO13773。菌株Jceto&cterATCC15164也是优选细菌的例子,其被保藏于ATCC。菌株G/wcowo6ac&r0x7cfaws("oge做s)N44-l是优选细菌的另一个例子,其是菌株IFO3293的衍生物,在Sugisawaetal.,Agric,:1201-1209,1990中对其有所描述。本发明的微生物可在DNA水平或蛋白质水平上携带其它修饰(见上文所述),只要此类修饰对从底物(例如葡萄糖)生产生物质的产率、产量和/或效率具有直接影响即可。此类其它修饰可以例如影响编码上文所述的氧化还原酶或异构酶的其它基因,特别是,编码NAD(P)-葡糖脱氢酶、PQQ依赖性葡糖脱氢酶、FAD依赖性葡萄糖酸盐/酯-2-脱氢酶、NAD(P)-