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作为生物传感器的内部参照的可氧化种类和使用方法.docx

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专利名称:作为生物传感器的内部参照的可氧化种类和使用方法
技术领域:
本发明总体上涉及生物传感器,且更具体地,涉及新的和改进的生物传感器,其包括作为内部参照的可氧化种类,还涉及该生物传感器的使用方法,以用于测定样品中物质的存在或者量。
现有技术描述体液中分析物的定量测定在诊断和某些生理学异常的维持中非常重要。例如,应该监控某些个体中的乳酸、胆固醇和胆红素。具体地,体液中葡萄糖的测定对于糖尿病个体非常重要,这些个体必须经常检查他们的体液中的葡萄糖水平作为调节他们的饮食中葡萄糖摄入的手段。尽管本公开内容的剩下内容将涉及葡萄糖的测定,但是将理解本发明的新的和改进的传感器元件和使用方法可以在选择合适的酶后测定其他分析物。
流体中分析物浓度的测定方法可以基于该分析物和对该分析物特异的酶和维持该酶处于其最初氧化状态的介体之间的电化学反应。适宜的氧化还原酶包括氧化酶、脱氢酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。例如,对于分析物是葡萄糖的情况,与葡萄糖氧化酶和氧的反应通过如下反应式表示
在反应式(A)表示的反应的初始步骤中,测试样品中存在的葡萄糖将酶
(Eox),如酶的氧化的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)中心转化成它的还原形式(Ered),例如,(FADH2)。因为这些氧化还原中心在酶分子内基本上是电绝缘的,所以在不存在不可接受的高细胞电压时,不发生任何可测量程度的向常规电极表面的直接电子转移。该系统的改进涉及在电极和酶之间使用非生理氧化还原偶联以在(FADH2)和电极之间往返运输电子。这通过下面的方案表示,其中氧化还原偶合剂(通常称作介体)由M表示
在该方案中,GO(FAD)代表葡萄糖氧化酶的氧化形式,GO(FADH2)表示它的还原形式。介导种类Mox/Mred将电子从还原的酶往返运输到电极,从而氧化该酶,导致它原位再生。
授予Genshaw等人并且转让给本受让人的美国专利号5,620,579和5,653,863公开了测定流体测试样品中分析物的浓度的装置和方法,其通过将流体测试样品应用于工作电极的表面来实施,所述工作电极电化学地连接对电极,并且其表面含有组合物,该组合物包含对所述分析物特异的酶。响应于分析物和酶之间的反应,介体被还原。在测定分析物的浓度之前在电极之间应用氧化电位以将至少一部分介体返回到它的氧化形式,从而增加分析物测定的准确性。在该最初应用的电位后,将电路切换到断路或者显著减小电流的电位,以使工作电极处电化学电位率最小化。在电极之间应用第二种电位并测量流体测试样品中产生的电流以测定分析物浓度。任选地,通过算法进一步增强分析物测定的准确性。
发明概述本发明的重要方面是提供新的和改进的生物传感器,其用于测定样品中物质的存在或者量,所述生物传感器包括作为内部参照的可氧化的种类,还涉及该生物传感器的使用方法。
简言之,提供了用于测定样品中物质的存在或者量的生物传感器和该生物传感器的使用方法。用于接收待分析的用户样品的生物传感器包括用于与分析物发生电化学反应的混合物。该混合物包括酶、介体和作为内部参照的可氧化的种类。
将内部参照定义为可氧化的种类,其在一个实施方案中可以进一步定义为可逆氧化还原偶的还原形式,其具有与介体相等或者更高的氧化还原电位。内部参照对于氧化两种种类的工作电位加性地增加响应电流,且对于分析物是葡萄糖的情况,总的响应电流通过如下表示
I总的=I内部参照+I葡萄糖I内部参照∝(内部参照)并且I葡萄糖∝(葡萄糖)其中I内部参照是由于内部参照造成的总响应电流的部分,而I葡萄糖是由于介体氧化造成的,其与葡萄糖浓度成比例。
根据本发明的特征,内部参照可以是相同的介体种类或者具有比介体更高的氧化还原电位的可氧化的种类。从而,对于具有仅氧化介体的低工作电位的生物传感器,电流I内部参照将为
0。然而,对于具有氧化两种种类的更高的工作电位的生物传感器,总响应电流将是由于内部参照导致的部分和由于葡萄糖导致的部分的总和。因为内部参照浓度是固定的,所以传感器的校准斜率将仅仅取决于葡萄糖的传感器响应而截距将取决于所加的内部参照的量。换句话说,内部参照将仅仅偏移截距并且不改变校准斜率。从而,内部参照的概念提供了制造葡萄糖生物传感器的新的且不同的方法。
附图简述从下面附图中阐明的本发明的优选实施方案的详细描述,可以最好地理解本发明以及上面和其他目的和优点。附图中
图1A是生物传感器计量器的方块图表示,该生物传感器计量器包括具有根据本发明的内部参照的生物传感器;图1B、1C和1D是分别阐明使用本发明的图1的生物传感器的操作方法的图解。
图2A、2B和2C显示了用亚铁***化物作为本发明图1的生物传感器的内部参照,在0mg/dL葡萄糖的全血样品中,基于MLB的葡萄糖生物传感器的三个循环伏安图。
图3是阐明了在不同电压工作电位下,本发明的图1的生物传感器的线性响应的图。
图4是阐明了使用本发明的图1的生物传感器,用10%印刷的铁***化物作为对电极,所加入的内部参照对总体伏安电流的影响的图。
图5A和5B是阐明了用Ag/AgCl作为对电极,本发明图1的基于MLB的生物传感器的线性响应和增加的内部参照导致的增加的截距的图。
图6A和6B是阐明了用10%铁***化物作为对电极,本发明图1的基于MLB的生物传感器的线性响应和增加的内部参照导致的增加的截距的图。
图7是阐明了用10%铁***化物作为对电极,本发明图1的DEX生物传感器的校准截距与增加的内部参照的线性关系的图。
图8A和8B阐明了本发明的图1的生物传感器的来自对照试剂墨水和向20%铁***%亚铁***化物的试剂墨水残留的亚铁***化物的流动注射分析(FIA)产生的信号与参照比。
优选实施方案的详细描述本发明涉及用于测定样品中物质的存在或者量的电化学生物传感器。该生物传感器包括含有工作电极和对电极的传感器条,工作电极和对电极的每一种都用例如,单独的试剂层至少部分覆盖。工作电极上的试剂层包括例如,通过氧化还原反应与分析物相互作用的酶并且还包括介体,其为氧化还原偶的氧化形式。本发明的生物传感器包括工作电极上试剂层中的内部参照或者还原形式的介体。将内部参照定义为可氧化的种类,其在一个实施方案中可以进一步定义为可逆氧化还原偶的还原形式,其具有与介体相等或者更高的氧化还原电位。在试剂层中提供了固定量的内部参照。包括内部参照或者加入量的还原形式的介体的本发明的生物传感器提供了改进,因为内部参照用于通过热力学性质使校准
截距稳定同时维持校准斜率。
许多化合物由于它们能够从还原的酶接受电子并将它们转移到电极而用作介体。介体的必要性质是在传感器使用前能够在电极表面上存在的条件下保持氧化状态。更古老的介体是氧化形式的有机金属化合物、有机分子、过渡金属配位络合物。介体的特定实例是六***基高铁酸钾(III),也称作铁***化物。
如在下面说明书和权利要求书中使用的,术语生物传感器指分析装置或者仪器的电化学传感器条或者传感器元件,其选择性地响应适宜样品中的分析物并将它们的浓度转化成电信号。生物传感器直接产生电信号,从而方便了简单的仪器设计。同样,生物传感器提供了低廉的材料成本的优点,因为将薄层化学药品沉积在电极上并且很少有材料浪费。
将术语“样品”定义为含有未知量的目的分析物的组合物。通常,用于电化学分析的样品是液体形式,且优选地该样品为水性混合物。样品可以是生物样品,如血液、尿或者唾液。样品可以是生物样品的衍生物,例如,提取物、稀释液、滤液或者重构的沉淀物。
将术语“分析物”定义为样品中的物质,其存在或者量待测定。分析期间,分析物与存在的氧化还原酶相互作用,并且可以是氧化还原酶的底物、辅酶或者影响氧化还原酶和其底物的相互作用的另一种
物质。
术语“氧化还原酶”定义为促进底物的氧化或者还原的任何酶。术语氧化还原酶包括“氧化酶”,其促进氧化反应,其中分子氧是电子受体;“还原酶”,其促进还原反应,其中分析物被还原并且分子氧不是分析物;和“脱氢酶”,其促进氧化反应,其中分子氧不是电子受体。见,例如,OxfordDictionaryofBiochemistryandMolecularBiology,修订本,,Ed.,NewYorkOxfordUniversityPress(1997),476,477,和560。
术语“氧化还原”反应定义为两种种类之间的化学反应,其涉及至少一个电子从一个种类向另一种类的转移。该类型的反应也称作“氧化还原反应”。该反应的氧化部分涉及一个种类丧失至少一个电子,且还原部分涉及向另一种类加入至少一个电子。被氧化的种类的离子电荷以等于转移的电子数目的量计电正性更强。同样的,被还原的种类的离子电荷以等于转移的电子数目的量计电正性更弱。
将术语“氧化值”定义为化学种类,例如原子的形式离子电荷。较高的氧化值,如(III),电正性更强,而较低的氧化值,如(II),电正性更弱。中性种类具有O离子电荷。种类的氧化导致该种类的氧化值的增加,而种类的还原导致该种类的氧化值的减少。
术语“氧化还原对”定义为具有不同氧化值的两种化学物质。具有更高氧化值的种类的还原产生具有较低氧化值的种类。备选地,具有较低氧化值的种类的氧化产生具有较高氧化值的种类。
术语“可氧化的种类”定义为具有较低氧化值的氧化还原对的种类,并且其从而能够氧化成具有较高氧化值的种类。同样的,术语“可还原的种类”定义为具有较高氧化值的氧化还原对的种类,并且其从而能够还原成具有较低氧化值的种类。
术语“有机过渡金属络合物”也称作“OTM络合物”,定义为这样的络合物,其中过渡金属通过σ键(结合过渡金属的碳原子σ上-1的形式电荷)或者π键(结合过渡金属的碳原子π上的O形式电荷)结合至少一个碳原子。例如,二茂铁是具有两个环戊二烯基(Cp)环的OTM络合物,每个环通过其5个碳原子通过2个π键和1个σ键结合铁中心。OTM络合物的另一个实例是铁***化物(III)和其还原的亚铁***化物(II)对应物,其中6个***基配体(6个配体的每个上-1的形式电荷)通过***基的碳原子σ结合到铁中心。
术语“配位络合物”定义为具有确定的配位几何形状,例如,八面体或者正方形平面几何形状的络合物。与OTM络合物(其通过它们的键合定义)不同,配位络合物通过它们的几何形状定义。从而,配位络合物可以是OTM络合物(如前面提到的铁***化物
),或者是这样的络合物,其中非碳的非金属原子,如杂原子(包括氮、硫、氧和磷)配价地结合到过渡金属中心。例如,钌六***或者六氨基钌酸盐(II)/(III)是具有确定的八面体几何形状的配位络合物,其中六个NH3配体(6个配体的每个上O形式电荷)配位地结合钌中心。铁***化物也是具有八面体几何形状的配位络合物的实例。关于有机过渡金属络合物、配位络合物和过渡金属键合的更完全的讨论可以见Collman等人,PrinciplesandApplicationsofOrganotransitionMetalChemistry(1987)和Miessler&Tarr,InorganicChemistry(1991)。
术语“介体”定义为可以氧化或还原并且可以在第一种物质和第二种物质之间转移一个或多个电子的物质。介体是电化学分析中的试剂并且不是目的分析物。在简化系统中,在氧化还原酶通过与适宜底物接触被还原或者氧化后,介体经历与氧化还原酶的氧化还原反应。该氧化或者还原的介体然后在电极经历相反反应并再生为其最初的氧化值。
术语“电活性有机分子”定义为不含有金属并且能够经历氧化或者还原反应的有机分子。电化学活性有机分子可以作为氧化还原种类和作为介体。电化学活性有机分子的实例包括辅酶吡咯并喹啉醌(PQQ)、苯醌和萘醌、N-氧化物、亚硝基化合物、羟***、8-羟基喹啉、黄素类、吩嗪、吩噻嗪、靛酚和吲达***。
术语“电极”定义为导电物质,其在电化学分析中保持稳定。电极材料的实例包括固体金属、金属糊、导电碳、导电碳糊和导电聚合物。
现在参考附图,在图1中阐明了生物传感器计量器,其总体由优选实施方案的参考字符100表示并且根据本发明的原理排列。生物传感器计量器100包括按照本发明的原理排列的生物传感器102。生物传感器计量器100包括微处理器104和相联的存储器106,所述存储器106用于存储程序和用户数据。将来自微处理器104的数字数据应用于数字-模拟(D/A)转换器108。D/A转换器108将数字数据转化成模拟信号。与D/A转换器108偶联的放大器110放大模拟信号。将放大器110的放大的模拟信号输出应用于本发明的生物传感器102。生物传感器102偶联放大器112。将放大的传感信号应用于模拟-数字(A/D)转换器114,其将放大的模拟信号转化成数字信号。将数字信号应用于微处理器104。
多数通过商业途径可获得的用于监控血液葡萄糖的一次性生物传感器需要沉积/印刷酶和介体与某种粘合剂的混合物。对于葡萄糖测量的应用,介体为氧化还原偶的氧化形式。取决于氧化还原偶,介体可以是非常强的氧化剂,如铁***化物,从而与酶和粘合剂混合后化学地氧化官能团。随后,在墨水混合、储存和印刷过程中,少量还原的介体形成为试剂中的杂质。从而,混合和印刷试剂墨水的最终结果是产生还原形式的氧化还原偶,从