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作为检测日光照射、前列腺癌和其它癌症的诊断工具的线粒体突变及重排的制作方法
本发明提供了可用于对于检测癌症和日光照射的线粒体DNA缺失。具体地,提供了检测线粒体DNA缺失以用于前列腺癌、日光照射和非黑色素瘤皮肤癌的早期检测、诊断和发展的方法和试剂盒。
【专利说明】作为检测日光照射、前列腺癌和其它癌症的诊断工具的线粒体突变及重排
[0001],原申请是国际申请PCT/CA2006/000652的中国国家阶段申请。
【技术领域】[0002]本发明涉及线粒体基因组学领域。具体地,其涉及线粒体基因组中的突变和重排,及其作为日光照射、衰老和疾病的发生或存在的指示因子的功用,例如在一般的临床症状显现之前检测肿瘤形成前、肿瘤形成以及向潜在恶性转化的进展。
【背景技术】
[0003]当前生物科学中的大趋势是人类基因组计划以及该数据的商业开发。然而,对这些信息的利用和实行存在例外的限制,因为该数据在个体水平上不是特异性的。令人难以置信的是,该数据仅来自少量个体,难以代表人类种群中存在的变异,从而使得该数据只能用于一般应用。人类基因组惊人的复杂性使基于个体基础的应用并不实际。为了对一个人类细胞核基因组进行完整测序,美国能源部和国立卫生研究院从
1988年起已投资25亿美兀()。
[0004]线粒体基因组
[0005]线粒体基因组是紧凑但却至关重要的核酸序列。线粒体基因组编码细胞呼吸所必需的酶亚基。与33亿bp的庞大核基因组相反,线粒体DNA(或“mtDNA”)是16,569个碱基对(bp)的小核酸基因组(Anderson等,1981!Andrews等,1999)。其遗传互补体比其同细胞的核小得多(%)。然而,个体细胞带有IO3至IO4中任意数目的线粒体,这取决于特定的细胞功能(SinghandModica-Napolitano2002)。在细胞核和线粒体基因组之间一般存在通讯或化学信号转导(Sherratt等,1997)。而且,特定的细胞核组分负责线粒体序列的维持和完整性(Croteau等,1999)。当这些细胞核区域由于指示潜在疾病的细胞核重排而失去功能时,接着mtDNA序列中也会开始出现突变。另外,可以通过线粒体基因组中由体细胞突变推动的缺失来对细胞内破坏鉴定特异性线粒体。这种理论性机制也可以用于指示将发生的疾病。线粒体需要约3,000种基因,其中只有37种由线粒体基因组编码,表明了线粒体对细胞核基因座的严重依赖
(Naviaux,1997)。
[0006]一旦发生受精,由于卵细胞中线粒体的克隆扩增,给定个体中所有线粒体DNA(mtDNA)基因组是相同的。mtDNA的关键作用是产生驱动细胞代谢的细胞燃料——三磷酸腺苷(ATP)。重要地,除了由线粒体基因组提供的13种多肽以外,该线粒体基因组依赖70种细胞核编码的蛋白质来完成该生命功能所必需的氧化和还原反应(Leonard和Shapira,
1997)。不同的组织和器官对氧化磷酸化的依赖程度不同。与氧化磷酸化(0XPH0S)缺陷相关的疾病看来与mtDNA突变有紧密的联系(Byrne,1992)。由于mtDNA突变的严重性提高而导致0XPH0S降低而超出了器官特异性能量阈值,这引起多种临床表型。而且,线粒体基因组中的突变与多种慢性退行性疾病有关(Gattermann等1995)。众所周知,衰老和特定类型的疾病可以使mtDNA发生改变或突变,使细胞的能量产生能力受损。这常常导致缺陷线粒体的过表达和/或细胞通过增加糖酵解来补充ATP的缺乏(Carew和Huang,2002);因此,当以连续的间隔进行监测时,线粒体基因组中的改变或突变可以用作疾病发生和/或疾病发展的标记。
[0007]最近,Fliss等(2000)在来自肺及膀胱的癌症的原发性肿瘤中发现了天然情况下主要为同质的mtDNA发生高频率突变,表明突变mtDNA在恶性肿瘤细胞中占多数。点突变和缺失看来是氧自由基对线粒体膜和基因组造成损伤的非程序性但却不可避免的副作用
(Miquel等1992)。这个理论看来言之有理,不仅因为线粒体基因组缺乏保护性组蛋白,还因为在产生氧的线粒体内膜附近发现了对氧化损伤的敏感性。而且,由于mtDNA具有紧凑的基因组并缺少内含子,因此有害事件很可能影响编码序列,引起生物化学功能异常。这种功能异常将进一步增加细胞的氧化应激,这将引起核及mtDNA的损伤,从而提高细胞进入癌化过程的可能性(Penta等,2001)。在这方面,研究表明随着年龄的增长,mtDNA的损伤增加(Cortopassi&Wangl995),呼吸功能随之衰退(Miquel等1992),最终导致细胞死亡。
[0008]mtDNA作为诊断工具
[0009]mtDNA序列动力学情况是重要的诊断工具。mtDNA中的突变常常是正在发展中疾病的先期指示,常常与细胞核突变有关,并作为与疾病特异性相关的生物标志物,所述疾病例如但不仅限于:吸烟和接触二手烟引起的组织损伤和癌症(Lee等,1998;ffei,1998);基于从约20岁开始并在之后逐渐提高的线粒体基因组突变累积的寿命((vonffurmb,1998);由突变或接触致癌物、诱变剂、紫外线辐射照射而引起的转移性疾病(Birch-Machm,2000);骨关节炎;心血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森病(Shoffner等,1993;Sherratt等,1997;Zhang等,1998);与年龄相关的听力丧失
(Seidman等,1997);视神经退化和心率失常(Brown等,1997;Wallace等,1988);慢性进行性externalexophthalmoplegia(Taniike等,1992);动脉硬化(Bogliolo等,1999);乳头状甲状腺癌和甲状腺瘤(Yeh等,2000)等等(例如Naviaux,1997;ChinneryandTurnbull,1999)。
`[0010]线粒体基因组特定位点的突变可与某些疾病相关。例如,在4216、4217和4917位的突变与Leber's遗传性视神经病变(LHON)(MitochondrialResearchSociety;Huoponen(2001);MitoMap)相关。在5/5个泛醇细胞色素C还原酶(复合体III)缺陷的患者中发现了15452位的突变(Valnot等1999)。然而,还未这些位点的突变与前列腺癌有关。
[0011]具体地,这些改变包括点突变(转换、颠换)、缺失(一个碱基至数千个碱基)、倒位、复制(一个碱基至数千个碱基)、重组以及插入(一个碱基至数千个碱基)。另外,特定的碱基对改变、缺失或其组合与前列腺癌、皮肤癌和肺癌的早期发作以及衰老(例如Polyak等,1998)、提如裳老、接触致癌物(Lee等,1998)等有关。
[0012]因为mtDNA仅通过卵细胞向后代传递,所以急需通过这种遗传手段了解线粒体序列。mtDNA的序列在母系谱系之间有广泛的变异(Ward等,1991),因此,必须与这种变异相比清楚地了解与疾病相关的突变。例如,若干个体的序列中与特定癌症相关的特定
T向C的转换实际上可能是在给定的特定地理区域或与种族相关的母系谱系中广泛的天然变异。例如,北美本地人表现出异常高的成年糖尿病发病频率。另外,所有的北美本地人在遗传上可表征为5个基本的母系谱系,命名为A、B、C、D和X(Schurr等,1990;Stone和Stoneking,1993;Smith等,1999)。谱系A的特点是具有单个点突变,导致线粒体基因组的663bp处出现HaeIII位点,然而在这种突变与成人糖尿病发病之间没有因果关系。另外,即使在谱系簇中也存在序列变异。
[0013]在与特定谱系相关的特定标记之外,种群内序列变异多于种群间序列变异(Easton等,1996;Ward等,1991,1993)。为了最佳地鉴定与疾病相关的突变,就必须了解这种趋异性,因此必须使用模拟纵向设计能力(即长期跟踪受试者)的母系研究法(Parsons等,1997)鉴定与疾病直接相关的突变,而不是物疾病相关性的突变。而且,特定的物质例如二手烟、低水平的石棉、铅、在许多环境中低水平的所有已知诱变剂可能是特定点突变的原因,但却不一定是疾病特异性标志物。因此,丰富的mtDNA序列数据库是准确预测潜在疾病为自然过程或是由于接触致病物质而引起的明确的必要条件。而且,必须对整个分子进行测序以得到其完整的信息内容。必须在整个线粒体基因组上将完整的点突变(转换、颠换
)、缺失(一个碱基至数千个碱基)、倒位、复制(一个碱基至数千个碱基)、重组以及插入(一个碱基至数千个碱基)表征为一个整体。这可确保所获得线粒体基因组中所有可能的可用信息。尽管与其核副本一样,胞质线粒体基因组(16,569bp)已在个体水平进行了测序,但是还未在种群水平对线粒体基因组进行测序以用作诊断工具。
[0014]最近,由于其在凋亡和其它肿瘤生物学方面中的作用(Green&Reed,1998,Penta等,2001),尤其是已在许多人类肿瘤中观察到mtDNA的体细胞突变(mtDNA)(Habano等1998;Polyak等1998;Tamura等1999;Fliss等2000),因此已经将线粒体与致癌过程相联系。特定的mtDNA突变似乎是同质的(Habano等1998;Polyak等1998;Fliss等2000),这些后面的发现更有意义。另外,研究者已发现,紫外线辐射(UV)对于非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的发生和发病是重要的(Weinstock1998;ReeS,1998),并且UV在人类皮肤中诱发mtDNA损伤(Birch-Machin,2000a)。
[0015]而且,线粒体序列随时间失去完整性。例如,4977bp缺失的频率随年龄增长而提高(Fahn等,1996)。从20岁开始,该缺失开始在少量线粒体中发生。至80岁时,大量的分子已发生缺失。该缺失表征了`正常衰老的过程,并作为该过程的生物标志物。对这种衰老过程的定量允许使用医学或其他方式的干预来延缓该过程。
[0016]这种线粒体基因组在医学中的应用受到了忽视,是因为mtDNA先前主要用作种群遗传学工具,最近用于取证;然而,越来越明显地,mtDNA的信息内容在医学诊断领域中具有重要的应用。而且,在最近高容量的高通量机器DNA测序系统出现之前,对全部mtDNA互补体进行测序是一项艰巨的任务。另外,种群遗传学家能够收集来自控制区中的两个高度可变区的重要数据;然而,这些小区域代表整个基因组中10%以下的一小部分,意味着该数据中90%的辨别力没有得到使用。很重要地,许多疾病相关地改变在控制区之外。为了精确并且高辨别地进行诊断,应该考虑整个基因组的特征,以包括所有的序列信息。
[0017]非黑色素瘤皮肤癌
[0018]人类非黑色素瘤皮肤癌(匪SC)在许多白种人群中是最普遍的癌症(Wemstock,1998;Rees,1998)0这些肿瘤中多数为基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)。BCC为局部侵袭性并可导致显著的发病率,但几乎不转移。SCC显示显著的转移潜力,并且免疫抑制的患者中多发性匪SC的发生导致严重的治疗问题(Rees,1998)。尽管BCC没有临床上可检测的恶化前损伤,但一些SCC认为是由前体损伤引起,也就是光化性角化病(AK)或鲍恩病(原位癌)(Rees,1998)。
[0019]SCC显示出影响某些染色体的杂合性丢失,提示某些肿瘤抑制子基因参与其发生。有趣的是,在AK中,这些前体损伤中观察到的基因丢失水平与
SCC相比相同或更高(Rehman等1994;Rehman等1996)。这对于本发明是很重要的,因为这提示除了肿瘤抑制子基因失活以外,在SCC的发生中还可能涉及其他机制。
[0020]在发现肿瘤细胞的呼吸系统受损并具有高糖酵解活性时,最先提出了线粒体在肿瘤发生发挥作用的假说(Shay&Werbin,1987)。最近的发现阐明了线粒体在凋亡中的作用(Green&Reed,1998),与结肠癌(Habano等1998;Polyak等1998,reviewedinPenta等,2001)、膀胱、颈和肺(Fliss等2000)的原发性肿瘤以及胃肿瘤(Tamura等1999)同质mtDNA突变的高发生率一起进一步支持了这种假说。而且,已经提出,这些线粒体突变可影响活性氧类别(ROS)的水平,已经显示ROS具有高促有丝分裂能力(Polyak等1998;Li等1997)。
[0021]本发明人及其它人在先前的研究中已显示mtDNA中的突变以及相关的线粒体功能异常是导致人类退行性疾病的重要促进因素(Birch-Machin等1993;Chinnery等1999;Birch-Machin等2000b)。这是因为,该细胞器中产生的大量ROS使线粒体基因组特别容易突变,同时与核相比缺乏保护性组蛋白并且mtDNA修复的速率很低(Pascucci等1997;Sawyer&vanHouten;LeDoux等1999)。实际上,mtDNA的突变率约比细胞核DNA高10倍(Wallace,1994)0
在最近的人类肿瘤研究中鉴定的多数mtDNA突变表明可能接触了ROS衍生的诱变剂。这对于匪SC中mtDNA突变研究十分重要,因为最近有证据表明UV诱导的ROS直接参与人类皮肤细胞mtDNA缺失的产生(Berneburg等1999,Lowes等,2002)。另外,无保护性色素沉着或遗传素因(geneticpredisposition)的个体中NMSC的主要决定因素是UV(WeinstOCk,1998)。还发现SCC推定的前体损伤主要发生在经常接受日光照射的部位上。这之所以重要,是因为Birch-Machin实验室的工作已经显示,取自接受不同日光照射的身体部位的皮肤中线粒体DNA损伤的发生频率之间存在不同的差异。发现绝大多数损伤位于经常接受日光照射的位点上(Krishanan等,2002)。
[0022]本发明的发明人之一首先定量显示了UV照射诱导mtDNA损伤(Birch-Machin等
1998)。作为分子标记,mtDNA用于研究人类皮肤中自然老化与光老化之间的关系。利用3-引物定量PCR(qPCR)方法研究与人类皮肤的日光照射和自然老化相关的4977bp缺失mtDNA与野生型mtDNA比例的改变。与避光部位(%[1/90])相比,日光照射部位的高水平4977bp缺失mtDNA的发生率(27%,[27/100])显著提高(即>1%)(Fishers精确检验,P