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专利名称:突变检测分析的制作方法
突变检测分析相关申请的交叉引用本申请要求2010年11月15日递交的美国专利申请系列号12/946,752的申请日的优先权,该申请公开的内容通过引用的方式并入本文。背景人类基因组中的一些点突变与疾病有直接关联。例如,发现一些生殖系KRAS突变与努南综合征(:331-6)和心-面-皮肤综合征(:294-6)相关联。同样,发现体细胞的KRAS突变在白血病、结直肠癌(:2403-7)、膜腺癌(:549-54)和肺癌(:1647-53)中高频出现。人类基因组中有许多点突变与疾病没有明显的致病关联。点突变的检测方法可用于,例如,提供与点突变相关联的疾病的诊断。概述本发明提供样品分析的方法。在某些实施方案中,所述方法包括:a)从样品扩增产物以产生扩增的样品,所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和所述基因组座位的突变体拷贝,所述突变体拷贝相对于所述基因组座位的所述野生型拷贝具有点突变,其中:;’末端核苷酸,还包含与所述基因组座位中除了在所述3’末端核苷酸
6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列;和b)使用活瓣分析(flapassay)检测所述扩增的样品中所述产物的存在,所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本发明还提供进行所述方法的试剂盒。
图1示例性说明了活瓣分析的一些一般原则。图2示例性说明了所述方法的一个实施方案。图3-7各提供更详细描述于本申请实施例部分的数据。定义本文使用的术语“样品”涉及材料或材料的混合物,通常情况下,尽管这不是必须的,以液体形式,含有一种或多种感兴趣的分析物。术语“核苷酸”旨在包括那些不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基而且包含已被修饰的其他杂环碱基的基团(moieties)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶,酰基化的嘌呤或嘧啶,烷基化的核糖或其他杂环。此外,术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记并可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖,而且也可以包含其他糖的基团。修饰的核苷或核苷酸也包括对所述糖基团的修饰,例如,一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代,官能化为醚、胺等。术语“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用,用于描述任意长度的聚合物,例如,长于大约2个碱基,长于大约10个碱基,长于大约100个碱基,长于大约500个碱基,长于大约1000个碱基,长达大约10,000个或更多碱基组成的核苷酸,例如,脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,并可通过酶法或合成法制备(例如,
PNA记载于美国专利号5,948,902和其中所引用的参考文献)其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交,该方式与两种天然存在的核酸杂交类似,例如,能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。本文使用的术语“核酸样品”指含有核酸的样品。
本文使用的术语“靶多核苷酸”指研究中的目的多核苷酸。在某些实施方案中,靶多核苷酸含有研究中的一个或多个目的靶位点。本文使用的术语“寡核苷酸”指大约2至200个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以通过合成或可以通过酶法制备,并且,在一些实施方案中,长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即,可以为寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如,寡核苷酸的长度可以为10至20、11至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。本文使用的术语“双链体”或“双链的”描述两个互补的碱基配对的多核苷酸,SP,杂交在一起。本文使用的术语“引物”指这样的寡核苷酸,其具有与靶多核苷酸的一个区域互补的核苷酸序列。在引物延伸条件下,使用靶核酸作为模板,引物结合至所述互补区域并延伸。引物可为大约15至大约50个核苷酸范围内,但也可使用在上述长度范围之外的引物。引物可通过聚合酶的作用从引物的3’末端开始延伸。不能通过聚合酶的作用从其
3’末端开始延伸的寡核苷酸不是弓I物。本文使用的术语“延伸”指向核酸末端添加一个或更多的核苷酸,例如通过寡核苷酸的连接或通过使用聚合酶。本文使用的术语“扩增”指使用靶核酸作为模板产生一个或更多拷贝的靶核酸。本文使用的术语“变性”指核酸双链体分开为两条单链。本文的术语“测定(determining)”、“测量(measuring)”、“评估(evaluating)”、“评估(assessing)”、“分析(assaying)”、“检测(detecting)”、“分析(analyzing)”可以互换使用,指任何形式的测量,并包括测定一种成分(element)存在与否。这些属于包括定性和/或定量测定。评估可为相对或绝对。“评估其存在”包括测定存在的某种物质的量,以及测定其存在或不存在。术语“使用”有其常规含义,因此,是指采用,例如,将方法或组合物付诸运行至结束。本文使用的术语“Tm”指寡核苷酸双链体的解链温度,在该温度,一半的双链体保持杂交而一半的双链体解离成单链。寡核苷酸双链体的Tm可以通过实验测定或使用下述公式预测:Tm=+(1g10[Na+])+(部分G+C)-(60/N),其中N是链长且[Na+]小于1M。参见Sambrook和Russell(2001;MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarborPress,.’)。还有其他预测寡核苷酸双链体的Tm的公式并且一个公式可以或多或
少地适用于给定的条件或一组条件。本文使用的术语匹配的”指多个核酸双链体有在定义范围内的Tni,例如,在互相的5°C或10°C范围内。
本文使用的术语“反应混合物”指试剂的混合物,所述试剂能够在能够在适当的外部条件下经过一段时间一起反应产生产物。反应混合物可以包含PCR试剂和活瓣切割试剂,例如,各自在本领域已知的配方。本文使用的术语“混合物”指成分的组合,所述成分是散在的并没有任何特定顺序。混合物是异质的且没有在空间上分离成其不同成分。混合物成分的实施例包括大量不同的溶解于相同水溶液的成分,或大量不同的附着到固相载体的成分或在没有特定顺序上不同成分在空间上没有不同。混合物是无法定位的(addressable)。举例说明,作为本领域中通常已知的,空间上分离的表面结合多核苷酸的阵列不是表面结合多核苷酸的混合物,因为此类表面结合多核苷酸空间上不同且所述阵列是可以定位的。本文使用的术语“PCR试剂”指对模板进行聚合酶链式反应(PCR)所必需的所有试齐U。正如本领域中已知的,PCR试剂基本上包括第一引物、第二引物、热稳定聚合酶和核苷酸。取决于所使用的聚合酶,也可存在离子(例如,Mg2+)。PCR试剂可以任选地包含可扩增靶序列的模板。本文使用的术语“活瓣分析”指一种分析,其中活瓣寡核苷酸以重叠依赖的方式通过活瓣核酸内切酶切割从而释放随后被检测到的活瓣。活瓣分析的原理众所周知并且记载于,例如,
Lyamichev等人.(:292-296)、Ryan等人(:135-44)和Allawi等人(:3443-3447)。为了清楚,某些应用于活瓣分析的试剂记载如下。活瓣分析的原理如图1所示。如图1所示的活瓣分析,侵入寡核苷酸2和活瓣寡核苷酸4与祀6杂交产生包含在位置10处有一个核苷酸重叠的第一复合体8。第一复合体8是活瓣核酸内切酶的底物。活瓣核酸内切酶12切割活瓣寡核苷酸4从而释放活瓣14,活瓣14与FRET盒16杂交,FRET盒16包含猝灭剂“Q”和附近的淬灭荧光基团“R”,“R”被猝灭剂Q淬灭。活瓣14与FRET盒16的杂交产生包含在位置20处有一个核苷酸重叠的第二复合体18。第二复合体也是活瓣核酸内切酶的底物。活瓣核酸内切酶12切割FRET盒16导致荧光基团22的释放,这产生荧光信号。这些成分在下面进行更详细的记载。本文使用的术语“侵入寡核苷酸”指一种与靶核苷酸的一个区域互补的寡核苷酸。侵入寡核苷酸的3’末端核苷酸可以与靶的核苷酸碱基配对,也可以不配对(例如,其可为SNP的位点或例如突变)。本文使用的术语“活瓣寡核苷酸”指一种包含活瓣区域和与靶核酸的区域互补的区域的寡核苷酸。侵入寡核苷酸上的靶互补区域和活瓣寡核苷酸重叠单个核苷酸,因而当它们与祀核酸退火时,互补序列重叠。正如已知的,如果
:a)侵入核苷酸的3’末端核苷酸和b)与活瓣寡核苷酸中的那个核苷酸重叠的核苷酸二者均与靶核酸中的核苷酸碱基配对,那么形成一种具体结构。这种结构是酶的底物,所述酶如下定义为活瓣核酸内切酶,其从活瓣寡核苷酸的靶互补区域切割活瓣。如果侵入寡核苷酸的3’末端核苷酸没有与靶核酸里的核苷酸碱基配对,或如果活瓣寡核苷酸中的重叠核苷酸没有与靶核酸中的核苷酸碱基配对,复合体不是所述酶的底物并只有很少或者没有切割。本文使用的术语“活瓣核酸内切酶”或简称“FEN”指一类核苷酸分解酶,其作为结构特异性核酸内切酶作用于DNA结构,所述DNA结构于一条链上包含单链5’突出端或活瓣,该条链被核酸的另一条链取代,即,使得在单链和双链DNA之间的交界处有重叠核苷酸。FEN催化单链和双链DNA交界处的磷酸二酯键水解断裂,释放所述突出端,或所述活瓣。活瓣核酸内切酶由Ceska和Savers(:331-336)及Liu等(:589-615)综述。FEN可以是单独的酶、多亚基酶或作为其它酶或者蛋白复合体的活性存在,例如,DNA聚合酶。活瓣核酸内切酶可以是热稳定的。本文使用的术语“切割的活瓣”指活瓣分析的切割产物的单链寡核苷酸。本文使用的术语“FRET盒”指包含荧光基团和附近的淬灭所述荧光基团的猝灭剂基团的发夹寡核苷酸。切割的活瓣与
FRET盒的杂交产生活瓣核酸内切酶所需的二级底物。一旦形成该底物,包含5’突光基团的碱基从盒切割出,从而产生突光信号。本文使用的术语“活瓣分析试剂”指对底物进行活瓣分析所需的所有试剂。正如本领域已知的,活瓣分析包括如上所述的侵入寡核苷酸、活瓣寡核苷酸、活瓣核酸内切酶和FRET盒。活瓣分析试剂可以任选地包含所述侵入寡核苷酸和活瓣寡核苷酸结合的靶。本文使用的术语“基因组座位”指基因组中的指定区域。基因组座位存在于来自同一个体的不同细胞的基因组的相同位置,或不同个体中。一个细胞或个体的基因组座位可有与不同细胞或个体的相同基因组座位相同或非常相似(即,超过99%相同)。不同细胞或个体中相同基因组座位之间核苷酸序列的差异可以是因为一个或多个核苷酸取代。SNP(单核苷酸多态性)是点突变的一种类型,在人群中不同个体之间相同的基因组座位中发生点突变。点突变可以是体细胞的,其发生在同一个体的不同细胞之间。基因组座位突变可通过基因组坐标、名称或使用符号进行定义。本文使用的“突变位点”指基因组座位中核苷酸取代的位置。除非另有说明,核酸中突变位点可具有突变体等位基因或突变的野生型等位基因。突变位点可通过基因组坐标或相对于基因起始密码子的坐标进行定义(例如,“KRASG35T突变”的情形)。本文使用的术语“点突变”指基因组座位的突变体拷贝的突变位点处的核苷酸的特性。所述核苷酸可位于双链
DNA分子的任一条链。本文使用的术语“野生型”,参照基因组座位,指含有野生型序列的基因组座位的等位基因。在含有SNP的基因组座位的情形下,野生型序列可含有SNP的主要等位基因。本文使用的术语“突变体”,参照基因组座位,指含有突变体序列的基因组座位的等位基因。在含有SNP的基因组座位的情形下,突变体序列可含有SNP的次要等位基因。基因组座位的突变体等位基因可含有核苷酸取代,其不是沉默的,因为其或者改变蛋白质的表达或者改变蛋白质的氨基酸序列,这导致细胞中的表型改变(例如,癌症相关表型),所述细胞相对于包含野生型序列的细胞其突变体序列是杂合的或纯合的。另外,基因组座位的突变体等位基因可含有沉默的核苷酸取代。本文使用的术语“相应于(correspondsto)”及其语法等价词在,例如,相应于突变位点的寡核苷酸中的核苷酸,的上下文中,旨在当两个核酸(例如,寡核苷酸和包含突变的基因组DNA)杂交时用来识别与突变位点相应位置相关(S卩,定位于对面的)的核苷酸。同样,除非另有指明(例如,在与点突变“没有碱基配对”或“碱基配对”的核苷酸的情形下)相应于突变位点的核苷酸可与序列的无论是突变体还是野生型等位基因碱基配对。包含“基因组座位野生型拷贝和基因组座位突变体拷贝二者”及其语法等价词的样品,指包含同一基因组座位的多个DNA分子的样品,其中样品包含基因组座位野生型拷贝
(其拷贝包含基因组座位的野生型等位基因)和同一基因组座位的突变体拷贝(其拷贝包含基因组座位的突变体等位基因)。在这个上下文中,术语“拷贝”并非旨在意味着序列互相拷贝。相反,术语“拷贝”旨在表明序列是不同细胞或个体的同一基因组座位的。本文使用的术语“核苷酸序列”指核酸中核苷酸的连续序列。显而易见的是,核苷酸序列中核苷酸的数量可以有很大差异。在具体实施方案中,核苷酸序列(例如,寡核苷酸的核苷酸序列)可以是长度足够与其他核酸中的互补核苷酸序列杂交的。在这些实施方案中,核苷酸序列的长度可为至少10至50个核苷酸,例如,12至20个核苷酸长,尽管超出这些范围的长度可用于很多情形。在与第二核酸完全互补的第一核酸的上下文中,本文使用的术语“与……完全互补”指当第一核酸中核苷酸的连续序列的每一个核苷酸与第二核酸中互补的核苷酸碱基配对的情形。正如下文将要记载的,核酸可以与其它序列“除了具有单个碱基错配之外”完全互补,意味着所述序列除了具有单个碱基错配之外完全互补(即,单个核苷酸没有与其它核酸中相应的核苷酸碱基配对)。本文使用的术语“引物对”用于指能够用于聚合酶链式反应来扩增基因组座位的两个引物。在某些情形下引物对可被认为包含“第一引物”和“第二引物”或“正向引物”和“反向引物”。任何这些术语的使用是任意的并且并未旨在说明引物与双链核酸的上面的链还是下面的链杂交与否