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伯醇的氧化和***化的制作方法
本发明涉及包括下述步骤的方法:提供下式的伯醇HO-(CH2)x-R1,其中R1选自–OH、-SH、-NH2和–COOR2,x是至少3且R2选自H、烷基和芳基,b)通过与NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述伯醇,和c)使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触,其中所述NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶,涉及用于实行该方法的全细胞催化剂和这种全细胞催化剂用于氧化伯醇的用途。
【专利说明】伯醇的氧化和***化
[0001]本发明涉及包括下述步骤的方法:
a)提供下式的伯醇HO-(CH2)x-R1,
其中R1选自-OH,-SH、-NH2和-COOR2,x是至少3且R2选自H、烷基和芳基,
b)通过与NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述伯醇,和
c)使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触,
其中所述NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶,
涉及用于施行所述方法的全细胞催化剂,和涉及这样的全细胞催化剂用于氧化伯醇的用途。
[0002]聚酰***是以重复的酰***基为特征的一类聚合物。与化学上有关的蛋白不同,术语
“聚酰***”通常涉及合成的、商购可得的热塑性塑料。聚酰***衍生自伯***或仲***,其通常在烃裂解中得到。但是,也可以使用衍生物,更精确地讲,氨基羧酸、内酰***和二***,用于聚合物的生产。另外,短链气态烷烃作为原料是令人感兴趣的,其可以用生物技术方法从再生原料起始得到。
[0003]许多在商业上具有巨大需求的聚酰***是从内酰***起始制备。例如,“聚酰***6”可以通过聚合ε-己内酰***得到,而“聚酰***12”可以通过聚合月桂内酰***得到。其它商业上感兴趣的产物包括内酰***的共聚物,例如ε-己内酰***和月桂内酰***的共聚物。
[0004]***类的常规化学工业生产依赖于化石原料的供给,是低效的,且在该过程中产生大量不希望的副产物,在某些合成步骤中最高达80%。这样的方法的一个例子是月桂内酰***的制备,其通常通过丁二烯的三聚化而得到。氢化该三聚化产物环十二碳三烯,并将由此产生的环十二烷氧化成环癸***,其随后与羟***反应生成环十二烷***肟(Cyclododecanonoxin),其最后经由贝克曼重排转化成月桂内酰***。
[0005]考虑到这些缺点,已经开发了使用生物催化剂从再生原料起始制备***的方法。PCT/EP2008/067447描述了使用细胞生产化学相关产物,更精确地讲ω-氨基羧酸的生物体系,所述细胞具有一系列合适的酶活性且能够将羧酸转化成相应的
ω-氨基。但是,在该方法中使用的得自恶臭假单胞菌iPsoudomormsputida)GPOl的AlkBGT-氧化酶体系的一个已知缺点是,它不能提供使脂族烷烃生成伯醇的选择性氧化。相反,产生多种氧化产物;尤其是,更高度氧化的产物(诸如相应的醛、***或相应的羧酸)的比例随着反应时间增加而增加(,(2011),EnzymeandMicrobialTechnology48,480-486),这相应地降低了期望的***的收率。
[0006]在该背景下,本发明的目的在于,提供使用生物催化剂氧化醇的改进方法。另一个目的是,如下改进所述方法,即增加收率和/或降低副产物浓度。最后,需要这样的方法,即其允许基于再生原料来生产聚酰***或用于生产聚酰***的原材料。
[0007]所述目的和其它目的通过本申请的主题和通过独立权利要求的主题得以实现,其中由从属权利要求得出实施方案。
[0008]根据本发明,所述目的在第一方面由包括下述步骤的方法实现:a)提供下式的伯醇HO-(CH2)x-R1,
其中R1选自-OH,-SH、-NH2和-COOR2,x是至少3且R2选自H、烷基和芳基,
b)通过与NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述伯醇,和
c)使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触,
其中所述NAD(P)+-醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶。
[0009]在所述第一方面的第一实施方案中,步骤a)通过下式的链烷H-(CH2)χ-R1
通过单加氧酶的羟基化进行,所述单加氧酶优选是重组的或分离的。
[0010]在所述第一方面的第二实施方案(其也是第一实施方案的一个实施方案)中,所述NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶是具有至少一个锌原子作为辅因子的NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶。
[0011]在所述第一方面的第三实施方案(其是第二实施方案的一个实施方案)中,所述醇驗皇赢隹燒这嗜热脂肪芽孢杆菌iBacillusstearothermophiIus)的醇脱氢酶(数据库代码P42328)或其变体。
[0012]在所述第一方面的第四实施方案(其是第一至第三实施方案的一个实施方案)中,所述单加氧酶选自:恶臭假单胞菌的AlkBGT,得自热带假丝酵母tropicalis'^得自鹰嘴豆(Cicerarietinum)的细胞色素P450。
·[0013]在所述第一方面的第五实施方案(其也是第一至第四实施方案的一个实施方案)中,所述转氨酶选自特征如下的转氨酶及其变体
:在与青紫色素杆菌QChromobacteriumViοlaceum)ATCC12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Val224对应的氨基酸序列的位置处,其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸,且在与青紫色素杆菌ATCC12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Gly230对应的氨基酸序列的位置处,其具有除了苏氨酸以外的氨基酸,且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。
[0014]在所述第一方面的第六实施方案(其也是第一至第五实施方案的一个实施方案)中,在分离的或重组的丙氨酸脱氢酶和无机氮源存在下进行步骤b)和/或步骤c)。
[0015]在所述第一方面的第七实施方案(其也是第一至第七实施方案的一个实施方案)中,在包含NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶、转氨酶、单加氧酶和丙氨酸脱氢酶的组中的至少一种酶是重组的,且以具有相应酶的全细胞催化剂的形式提供。
[0016]在所述第一方面的第八实施方案(其也是第七实施方案的一个实施方案)中,所有酶以一种或多种全细胞催化剂的形式提供,其中,优选地,一种全细胞催化剂具有所有必需的酶。
[0017]在所述第一方面的第九实施方案(其也是第一至第八实施方案的一个实施方案)中,在步骤b)时,优选在步骤b)
和c)时,存在有机共溶剂,其具有大于-、。
[0018]在所述第一方面的第十实施方案(其也是第九实施方案的一个实施方案)中,所述共溶剂选自不饱和脂肪酸,优选油酸。
[0019]在所述第四方面的第十一实施方案(其也是第九实施方案的一个优选实施方案)中,所述共溶剂是式R3-O-(CH2)x-0-R4的化合物,其中R3和R4各自且彼此独立地选自:***、乙基、丙基和丁基,且X是1-4,其中特别优选R3和R4各自是***且X是2。
[0020]在所述第一方面的第十二实施方案(其也是第九实施方案的一个优选实施方案)中,所述共溶剂选自二烷基醚,并且优选二甲醚。
[0021]根据本发明,所述目的在第二方面中通过全细胞催化剂得以实现,所述全细胞催化剂具有NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶(优选地,具有至少一个锌原子作为辅因子)、转氨酶、任选的单加氧酶和任选的丙氨酸脱氢酶,其中所述酶是重组酶。
[0022]根据本发明,所述目的在第三方面中通过根据本发明的第二方面的全细胞催化剂用于氧化和***化式(HO)-(CH2)x-R1的伯醇的用途得以实现,其中R1选自-OH、-SH、-NH2和-COOR2,X是至少3,且R2选自H、烷基和芳基。
[0023]在第三方面的第一实施方案(其是第一实施方案的一个实施方案)中,所述用途进一步包括有机共溶剂的存在,所述有机共溶剂具有大于-、,且优选地为二甲醚。
[0024]在第三方面的第二实施方案(其是第二实施方案的一个实施方案)中,所述共溶剂选自不饱和脂肪酸,且优选地是油酸。
[0025]所述第二和第三方面的其它实施方案包括本发明的第一方面的所有实施方案。
[0026]本发明的发明人已经惊讶地发现,存在一组醇脱氢酶,其可以用于实现形成少量副产物伯醇的氧化。
[0027]本发明的发明人此外已惊讶地发现,存在可以使用生物催化剂将醇***化而不形成大量副产物的酶活性级联,其`中不必添加或除去还原当量。
[0028]本发明的发明人此外已惊讶地发现了可以令人惊讶地使用全细胞催化剂并从再生原料出发生产聚酰***的方法。
[0029]本发明的发明人此外已惊讶地发现,事先氧化后的伯醇的***化可以特别有利地用以某些序列特性为特征的转氨酶集合来进行。
[0030]本发明的发明人此外已惊讶地发现,在包含醇脱氢酶、转氨酶和丙氨酸脱氢酶的氧化和***化伯醇的体系中使用不同于AlkJ类型的醇脱氢酶,尤其是使用NAD(P)+-依赖性醇脱氢酶对该方法的产率是有利的,尤其是在使用全细胞催化
剂进行时。
[0031]根据本发明的方法可以应用于大量的工业相关的醇。在一个优选的实施方案中,其涉及可氧化和***化成ω-氨基羧酸的ω-羟基羧酸或酯,优选甲酯。在另一实施方案中,其涉及可氧化和***化成二***的二醇。在另一个优选的实施方案中,所述伯醇是羟基烷基***。在此,碳链的长度是可变的,并且X为至少3。所述碳链优选具有多于3个的C-原子,即X=4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。示例性化合物包括ω-羟基月桂酸、ω-羟基月桂酸甲酯,和链烷二醇,尤其是1,8_辛二醇和1,10-癸二醇。
[0032]在一个特别优选的实施方案中,R1选自-OH和-C00R2,χ是至少11,且R2选自H、***、乙基和丙基。在一个最优选的实施方案中,所述伯醇是ω-羟基脂肪酸甲酯。
[0033]根据本发明,在所述方法的步骤b)中,使用NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶用于氧化伯醇。在该情况下,与根据本发明使用的所有的酶活性多肽一样,其可以是包含酶活性多肽的细胞或其裂解物、或处于所有纯化阶段(从粗制的裂解物至纯的多肽)的多肽的制品。本领域技术人员已知大量可以在合适的细胞中过表达酶活性多肽并进行纯化和/或分离的方法。因而,为表达多肽,可以使用本领域技术人员可得到的所有表达体系。可以使用色谱方法用于纯化,例如提供了标记的重组蛋白的亲和色谱使用固定化的配体的纯化,所述固定化的配体为例如在组氨酸标记的情况中镍离子、在与靶蛋白融合的谷胱甘肽
-S-转移酶的情况中使用固定化的谷胱甘肽或在包含麦芽糖结合蛋白的标签的情况中使用固定化的
麦芽糖。
[0034]可以以可溶形式或固定化地使用经纯化的酶活性多肽。本领域技术人员已知可以将多肽共价地或非共价地固定至有机或无机固相上的合适方法,例如通过巯基偶联化学(例如得自Pierce的试剂盒)。
[0035]在一个优选的实施方案中,所述用作全细胞催化剂或用作表达体系的细胞是原核细胞,优选细菌细胞。在另一个优选的实施方案中,其是哺乳动物细胞。在另一个优选的实施方案中,其是低等真核细胞,优选是酵母细胞。示例性的原核细胞包括埃希氏菌属(Mscherichia),特别是大肠杆菌(Mscherichiacoli),和假单胞菌属iPseudomorms)和棒状杆菌属(JJorynebeicterium)的菌株。示例性的低等真核细胞包括酵母属(SaccAan謂Fees)、假丝酵母属(Caflt/ii/a)、毕赤酵母属CPicAia)、耶氏酵母属(Jarrowia)、裂殖酵母iSchizoseiccheiromycos)属,特别是热带假丝酵母(Candidatropicalis)、粟酒裂殖酵母
(^^I'zosaccAairmj^cespombe)>巴斯德毕赤酵母CPicAia解脂耶氏酵母(Farroiri'alipolytica)和酿酒酵母菌cerivisiae)菌株。
[0036]在一个特别优选的实施方案中,所述醇脱氢酶是含锌的NAD(P)+依赖性的醇脱氢酶,即所述催化活性酶包含至少一个锌原子作为辅因子,所述锌原子通过包含半胱氨酸残基的特征序列基序与所述多肽共价结合。在一个特别优选的实施方案中,所述醇脱氢酶是嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶(数据库代码P42328)或其变体。
[0037]本发明的教导不仅可以使用本文描述的生物大分子的精确氨基酸序列或核酸序列来完成,而且也可以使用这样的大分子的变体来完成,所述变体可以通过一个或多于一个氨基酸或核酸的缺失、添加或置换而得到。在一个优选的实施方案中,表述核酸序列或氨基酸序列的“变体”(其在下文中与本文中使用的表述“同源体”同义地和可互换地使用)是指另一个核酸-或氨基酸序列,考虑到相应的原始野生型-核酸-或-氨基酸序列,具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性(在这里与同一性同义使用),其中,优选地,除了形成催化活性中心的那些氨基酸或者结构或折叠必需的氨基酸以外的氨基酸被删除或置换,或者后者仅仅是保守置换,例如谷氨酸替代天冬氨酸、或亮氨酸替代缬氨酸。现有技术描述了可以用于计算2个序列的同源性程度的算法,例如