以肿瘤chk1为药靶抗癌重组腺病毒的构建方案及用途的制作方法.docx

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专利名称:以肿瘤chk1为药靶抗癌重组腺病毒的构建方案及用途的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种人类5型腺病毒(Humanadenovirustype5,ADV5)重组体的构建方案,其技术特征在于定向缺失ADV5基因组的923-946nt序列(CTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTT,该序列编码E1A蛋白122至129位氨基酸),在此基础上,进一步缺失ADV5E3区28532-29360nt,在该缺失区域引入一个ClaI酶切位点;在ClaI酶切位点中反向插入620bp的外源性CHK1cDNA片段(相当于CHK1mRNA的853-250nt),从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1。本发明属于医学基因工程技术领域。
背景技术:
恶性肿瘤正在成为危害人类健康的首要疾病。据国内最新流行病学调查资料显示我国现有癌症病人300多万人,每年死于恶性肿瘤的患者约为130万人,每年有160万到200万新发的恶性肿瘤病例,并以3%的速度递增,给我国人民的生活和健康造成巨大威胁,一定程度上制约了我国经济的可持续发展。
目前,多数常见肿瘤的治疗仍面临着严峻的挑战,常规的肿瘤治疗手段无法从根本上清除恶性肿瘤,因此,迫切需要在肿瘤治疗方法上进行创新。
在肿瘤发病内在分子机制逐渐明了的新的历史条件下,肿瘤分子医学理论和方法学的突破引发了一系列发展新型肿瘤治疗模式的尝试,用于治疗慢性粒细胞白血病的新药Gleevec正式成为临床处方药,大量分子靶点特异性抗癌化合物进入临床试用,标志着肿瘤治疗的突破到了一个关键的转折点,并已获得阶段性成果,初步凸显出未来肿瘤问题解决的基本轮廓,其最为核心的解决方法之一就是要从肿瘤繁复的基因调控网络中分解出最为关键的分子靶标,实施分子靶向治疗。截止至2001年底,获FDA批准进入临床实验阶段的分子治疗品种已超过三千种,包括细胞传导阻断剂、血管生成抑制剂、肿瘤疫苗和单克隆抗体,为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望,可以说,未来人类肿瘤的有效控制在根本上依赖分子治疗的发展完善。
分子治疗的主要手段主要分为三类单克隆抗体、小分子化合物和基因治疗。
基因治疗作为近年医学领域发展中最具有生命活力的部分之一,已广泛应用于多种肿瘤的临床试验性治疗,显示出良好的应用前景。从1989年至2000年底,美国生物制品评价和研究中心(CenterforBiologicsEvaluationsandResearch,CBER)批准的临床基因治疗试验项目已超过
350项,其中约有70%的项目为肿瘤基因治疗,部分已经进入III期临床试验,取得较好疗效,在巨大的医疗需求的推动下,基因治疗制剂将有可能在数年内正式上市成为临床治疗药物,成为肿瘤现有治疗体系的一个不可缺少的组成部分。
重组ADV5载体作为肿瘤基因治疗应用最为广泛的载体之一,其临床可行性和安全性已获公认,腺病毒基因治疗载体具有以下突出的生物学优势和临床应用优势(1)感染谱广,对多种组织源性的肿瘤细胞,无论是处于分裂期还是静止期的细胞,均能有效攻击,因此,抗癌谱广;(2)ADV-TK进入细胞后,以染色体外的形式存在,无突变、致癌的危险性,临床应用安全,使用后仅产生类似感冒样症状,无造血功能和免疫功能抑制;(3)临床应用方便,可通过腔隙(腹腔、胸腔和颅腔等)给药、局部或瘤体内直接注射(一点或多点)以及介入治疗等途径应用;(4)ADV-TK在细胞体内持续表达仅2-3周,尤其适合肿瘤治疗;(5)经静脉或局部应用后仅产生轻微的炎症反应,副作用轻微;(6)临床级数量、质量的腺病毒易于生产、纯化。
目前肿瘤临床试用的绝大部分载体为缺失了E1及E3区的复制缺陷性腺病毒,进入肿瘤病灶后,对肿瘤的杀灭效应依赖于体外高浓度治疗腺病毒的输入,距离注射点较远的病灶的杀灭效应较弱。为此,近年来,出现了从复制缺陷性腺病毒载体向条件复制性腺病毒载体
(conditionallyreplicativeadenovirus)转化的新的发展趋势,所谓条件复制性腺病毒载体是指载体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖,将肿瘤细胞作为生产腺病毒的场所,最终达到裂解杀灭肿瘤细胞的治疗目的,肿瘤细胞裂解释放出高浓度的腺病毒后,可进一步感染距离注射点较远的病灶肿瘤细胞,形成新一轮的感染波,周而复始形成一种正反馈,达到最大的治疗效应。此类载体另一个非常理想的优势是它们不能在正常细胞内完成复制,因此对正常细胞无任何杀伤效应,某些权威医学杂志通俗地将之比喻为杀灭肿瘤的“聪明炸弹”(smartbomb)。在实际应用中,取得了较好的预期效果。在第21届美国肿瘤研究年会上,来自休斯顿Anderson肿瘤中心的一份研究报告表明局部注射后,复制缺陷性腺病毒在人体恶性胶质瘤病灶中的分布较局限,在一定程度上影响了疗效的发挥,与此形成鲜明的对比,能在肿瘤细胞内特异性复制的腺病毒ONYX-015,通过在肿瘤局部的增殖,其分布遍及全瘤灶,取得显著疗效。ONYX-015是美国ONYX药物生物技术公司近年研制出的能在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒,其构建特点是在野生型人类5型腺病毒(wild-type)的基因组上,部分缺失(delete)E1B55kDa的编码序列,并加入翻译终止信号,但保留19kDaE1B的编码序列。在正常情况下,野生型腺病毒在细胞内的复制增殖依赖于E1B55kDa蛋白对p53蛋白功能的灭活。在携带正常
p53基因的正常细胞,ONYX-015由于缺乏E1B55kDa,不能在细胞内复制增殖。相反,由于恶性肿瘤患者p53基因的失活率高达50-70%,ONYX-015因而能在肿瘤细胞中增殖复制最终裂解细胞,因而ONYX-015具有杀灭肿瘤细胞的高度选择性,而对正常细胞无杀伤效应。
作为条件复制性腺病毒载体代表产品的ONYX-015在1996年进入临床试验以来,已经取得了非常令人鼓舞的临床疗效,国际著名的医学期刊《TheLancet》在以《基因治疗的新希望》为题的述评中,高度评价ONYX-015的临床应用前景,国际最著名的医学期刊如《Science》、《NatureMedicine》发表了临床试验结果及评论性文章。目前,美国辉瑞(pfizer)药物公司已从ONYX生物技术公司购买使用专利,并已在多种肿瘤进行临床期试验,其中,对复发性、难治性头颈部肿瘤的治疗正进行临床III期试验,已取得非常满意的疗效,对其他肿瘤如转移性结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oralleukoplakia)和恶性胶质瘤的临床I-II期试验正在进行中,同时,ONYX已经获得以ONYX-015为载体的一些相关的基因治疗重组腺病毒载体(如插入治疗基因TK,CD)的专利,正从临床前期试验向临床期试验过渡。可以预见,ONYX-015及其相关的基因治疗产品在不久的将来,在美国将正式进入临床应用,在癌症基因治疗的临床开发产品中显示出非常良好的临床应用前景。国内已有4例与ONYX-015类似原理的专利申请专利申请
“一种缺陷型病毒及其构建方法”()通过缺失E1B55kDa位于2809-3329bp编码序列,并在缺失部位插入终止码的方法得到E1B55kDa部分缺失的构建体;专利申请“缺失凋亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用”(),部分缺失E1B55kDa编码序列,并在该缺失部位插入标志基因LacZ,得到E1B55kDa部分缺失同时携带标志基因的病毒构建体,该构建体的另一特点是有E3区的缺失;专利申请“一种缺失E1A编码序列的重组腺病毒构建的获得及用途”(),缺失E1A(382-1630nt)序列,筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体;专利申请“一种联合缺失19kDa、55kDaE1B编码序列重组腺病毒构建体的构建及用途”(),通过联合缺失19kDa、55kDaE1B编码序列,筛选出不能表达E1B功能蛋白的重组腺病毒构建体。
国内外现有的条件复制性腺病毒载体发明与第一代ADV5基因治疗载体相比,无论在治疗原理上,还是在实际治疗效果上均具有明显的改进,并取得突破性进展,被称为第二代ADV5基因治疗载体。然而,第二代ADV5基因治疗载体均有一些共同的缺点(1)基于腺病毒生物学基础设计的载体虽然具备肿瘤条件复制性的治疗优势,由于设计上的种种不足,获取的腺病毒在肿瘤细胞中的复制、裂解肿瘤细胞的效力远远弱于野生型
ADV5,如单用ONYX-015的抗癌有效率仅为0-14%。(2)第二代ADV5基因治疗载体的应用仍以肿瘤局部注射为主,在应用中受到极大的限制,在绝大部分情况下,肿瘤是一种全身性疾病,需经静脉用药的途径进行系统性治疗,以控制原发及转移病灶,因此,第二代ADV5基因治疗载体的选择性和对肿瘤细胞的杀伤效率须进一步加强,以适应改进用药途径的需要。(3)第二代ADV5基因治疗载体均未携带有效的治疗性目的基因,使治疗效应的发挥受到限制。(4)由于现有的分子靶点绝大部分缺乏肿瘤特异性,以第二代ADV5基因治疗载体结合外源性启动子,治疗基因的策略虽然具有相对的肿瘤选择性,但仍不能避免对正常组织细胞的毒性作用。
另外,近年来已经确定了许多肿瘤分子药靶,针对这些分子药靶设计单克隆抗体、小分子化合物,已成为肿瘤治疗发展的主要趋势,其中,一部分已经成为处方药,尚有大量的分子治疗手段正在临床试用评估阶段,取得了较好的初步结果。尽管如此,由于这些新的分子靶点及其分子阻遏手段,绝大部分缺乏肿瘤特异性,由此产生的剂量限制性毒性,仍然是这些疗法目前普遍面临和亟待解决的关键问题,极大地限制了肿瘤问题的解决。
发明内容
基于以上技术背景和重大的医疗需求,本发明将公开一种第三代
ADV5基因治疗载体的构建方案,通过该方案获得的构建体具有肿瘤特异性复制、肿瘤特异性表达外源性插入反义基因、肿瘤特异性旁观者效应等明显的优势,并具备高度的治疗指数,适于静脉用药,可以解决目前肿瘤治疗技术和实践中关键的不足之处。
本发明的理论基础基于现有对ADV5腺病毒生物学的深入认识和研究。当ADV5进入细胞后1小时内,ADV5就会表达出E1A功能蛋白,其生物学效应主要包括两方面首先,E1A蛋白结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)蛋白,使宿主细胞内源性转录因子E2F从Rb-E2F的复合物中释放出来,与此同时,E1A蛋白将激活ADV5表达出E1B功能蛋白,以此灭活宿主细胞内源性转录因子P53对细胞周期驱动激酶的抑制,在E1A、E1B和E2F的共同驱动下,宿主细胞进入DNA合成期,为腺病毒基因组的自我复制提供前提条件;其次,ADV5依赖E1A蛋白激活ADV5的早期基因(E1B,E2,E3,E4)和晚期基因(L1-6)的表达,为腺病毒基因组的自我复制、腺病毒颗粒的包装、逃避宿主细胞的免疫清除、裂解细胞、释放腺病毒颗粒、再感染等完整的生命周期提供允许环境。由此可见,ADV5依赖E1A蛋白启动其序贯性的生命周期,最终裂解宿主细胞。
功能蛋白E1A的编码序列位于ADV5基因组560-1112nt,1229-1545nt,包含三个重要序列分别为677-799nt,此序列为E1A保守序列1(CR1),用于结合转录辅助因子P300;917-979nt
为E1A保守序列2(CR2),用于结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb);1007-1115nt为保守序列3(CR3),为基因转录激活区。
由于几乎所有的肿瘤均存在Rb调控径路的缺陷,如果对E1A917-979nt的CR2区加以不同的缺失改造,达到在灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果,那么,由此获取的腺病毒重组体将有可能在肿瘤细胞内有效复制,最终杀灭肿瘤细胞。另一方面,正常细胞具有的Rb调控径路,可以有效遏止腺病毒重组体依赖E1A蛋白启动其序贯性的生命周期,最终仅形成流产感染。这一理论推测已经为近来二个独立的研究组的工作所证实,Fueyo等(Oncogene,2000,192-12)构建了缺失E1A923-946nt的腺病毒重组体,观察到该腺病毒重组体选择性地在肿瘤细胞内复制,其复制特性强于野生型腺病毒,而对正常细胞无任何毒性作用,单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长;Heise等(NatureMedicine,2000,101134-1139)更深入地证实该构建体对肿瘤细胞具有高度选择性,从静脉单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长并抑制肿瘤转移。
尽管Fueyo与Heise等的前期工作为发展第三代ADV5基因治疗载体提供了关键的理论线索,他们的工作仍有明显的不足之处,他们发展出的ADV5基因治疗载体不包含任何插入性外源性治疗基因,限制了抗肿瘤效应的发挥。为此,本发明在此基础上构建一种新型的
ADV5重组体,其技术特征在于定向缺失ADV5基因组的923-946nt序列,并进一步缺失ADV5E3区28532-29360nt,在该缺失区域引入一个ClaI酶切位点;在ClaI酶切位点中反向插入620bp的外源性CHK1cDNA片段(相当于CHK1mRNA的853-250nt),从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1。
CHK1基因全称为细胞周期检测点激酶基因1,是DNA损伤细胞周期检测点的关键激活基因,已有充分的证据表明CHK1是细胞必要的生存基因,而灭活CHK1将直接诱导细胞凋亡,因此,在本发明中被选为分子药靶。
与现有的重组腺病毒构建体相比,本发明达到了以下效果1、该重组腺病毒构建体缺失E1A蛋白的923-946nt序列,缺失范围小于Fueyo与Heise等报道的构建体,在理论和实际上达到了在灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果。更为重要的是,我们在Δ923-(相当于CHK1mRNA的853-250nt),使反义CHK1cDNA的表达依赖ADV5自身E3区转录单位的内源性启动子,该启动子具有类似CMV启动子的高活性,启动子的开放完全依赖于腺病毒在细胞内的复制,腺病毒如不复制,外源性反义CHK1cDNA将不表达。由于这种全新的设计,使这一新的构建体可通过三重机制达到选择性杀灭肿瘤细胞的治疗目的,即构建体只在肿瘤细胞内的复制,可使外源性反义