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专利名称:从发酵液中回收不溶解酶和不溶解酶的制剂的制作方法
技术领域:
本发明涉及在存在微生物细胞或细胞碎片时从微生物发酵液中回收一种或多种目的酶的方法,以及从含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物制备的固体和液体制剂。
背景技术:
从微生物发酵液中常规回收液体或固体产物形式的工业用酶通常包括几个加工步骤。最常规的回收方法包括顺序发生的四个相似步骤去除微生物发酵液中非产物的不溶解成分;分离产物;纯化;禾口精炼(见例如EnzymesinIndustry=ProductionandApplications(2007)WolfgangAehle,H,HH片反,ffiley-VCH,M49;BioseparationsScienceandEngineering(2003),页Todd,,,OxfordUniversityI^ress,页32.)。例如,回收和配制细胞内产生的酶通常包括下列加工步骤(1)细胞裂解;(2)预处理;(3)细胞分离;(4)浓缩;和(5)配制-(a)为了液体稳定性进行化学添加,然后是精细过滤;或(b)为了固体稳定性进行化学添加,然后是干燥。细胞裂解通过破坏细胞壁从细胞中释放目的酶。细胞裂解可以通过下列方法进
行使细胞接触降解细胞壁的酶如溶菌酶,诱导发酵环境改变如改变PH、温度、溶解的氧浓度、葡萄糖浓度、盐浓度或其它添加剂的浓度而造成自发裂解,机械破坏细胞壁如勻浆化或这些方法的组合。对于在细胞外表达的酶(分泌进入培养基),细胞裂解是可选的。(见例如IsolationandPurificationofProteins(2003)-,编,MarcellDekker,Inc.,页1-27.)。细胞裂解后进行细胞分离步骤以产生含有目的酶的澄清溶液。通常,细胞分离包括离心和/或过滤从而去除在发酵过程中和/或发酵后产生的细胞碎片和任何不溶解的物质,和/或由于细胞裂解产生的细胞碎片和任何不溶解物质。适当的离心方法包括盘栈(diskstack)离心或沉降式离心(decantercentrifugation)。适当的过滤方法包括旋转真空过滤、通过板框式压滤机过滤或通过膜微滤器过滤。使用离心进行细胞分离通常是在澄清度和物料通过量之间的折中方案。常见的做法是使用高通过量离心,然后经过高通过量过滤去除痕量悬浮固体,其量足以干扰随后加工步骤。如今实践中的大多数过滤方法需要使用加工助剂如硅藻土等和碳(PcT申请号W001/87468)从而获得分离效率。硅藻土改善过滤处理的通过量和过滤澄清度。从含有目的酶液体中物理性分离细胞或细胞碎片之前,通常进行预处理步骤。由于碎片的颗粒尺寸小和裂解的发酵液的粘稠性质,没有这样的步骤而分离细胞碎片
通常是不经济的和耗时的。通常,预处理包括将絮凝剂引入裂解的或未裂解的发酵液中。聚合电5解质作为增加从发酵液中去除细菌细胞的细胞絮凝方法受到更多的关注。Baran(1988):259-264;Bautistaφ人(1986):315-318;ChenandBerg(1993):1775-1784;Cummingψ人(1996):55-60;Hustedt禾口Theelen(1989)DeChemaBiotechnologyConferences-VCHVeragsgesselschaft3:1071-1075;Ramsden等人(1998):599-603;Shan等人(1996):173-178。絮凝作用促进从含有目的酶的液体部分中去除细胞碎片。一些常用的絮凝剂包括聚乙烯亚***、聚二烯丙基二******化铵和***丙烯酰氧乙基三******化铵-丙烯酰***共聚物(methacryIoyloxyethyltrimethylammoniumchloride-acrylamidecopolymer)0细胞碎片的絮凝是基于电荷的现象,需要低离子强度得以有效进行。因此,通常需要用水稀释发酵液而将细胞碎片絮凝。取决于所需最终产物浓度和纯度,含有来自细胞分离步骤的目的酶的澄清液体可以达到配制需要而制备产品。但是,配制前通常需要进一步的加工从而增加酶的浓度。浓缩包括脱水,其通常通过超滤或对于热稳定的酶而言通过蒸发而实现。其它的浓缩方法包括沉淀、结晶和
色谱。(见例如PCT申请号WO91/09941)。由于涉及的成本,这些不是工业酶回收的常见做法。如上面概括的,常规回收和配制酶包括多个步骤。每一个加入制造过程的步骤都降低总处理产率并以能源、时间和劳动力的形式增加了成本。表达技术的进步已经能够获得相对高的发酵液中酶浓度(例如10-100g/l)的能力。在一些情况下,表达水平超过了目的酶的溶解力极限,并且在发酵的末尾,酶以沉淀或结晶的形式存在。当使用上述传统回收方法从发酵液中回收酶时,酶沉淀将在细胞分离步骤中与不溶解的细胞碎片和其它不溶解物质一起被同时去除。因此,回收的产率低。对该问题提出的一个解决方法包括在回收步骤后立即向过饱和酶溶液中加入多元醇以防止其沉淀(欧洲专利号EP1417301)。但是,这样的方法需要额外的原料消耗并向回收方法加入了额外步骤。不添加多元醇而回收不溶解酶的方法将是有利的。含酶颗粒在几种工业中被掺入至产品中,上述工业包括去污剂、纺织加工、食品(例如烘烤)、动物饲料和燃料乙醇工业。这样的颗粒可以通过许多技术包括流化床喷涂、高剪切造粒法、挤压、滚圆、颗粒化(prilling)和喷雾干燥制备。传统地,这样的含酶颗粒含有掺入颗粒前是可溶形式的酶,并且如果表达在微生物宿主中,是至少部分纯化的,从而去除微生物细胞和/或细胞裂解产生的细胞碎片。在不溶解酶存在于微生物发酵液中的情况下,在回收前需要进行溶解。在一些情
况下,这可以通过改变PH和/或温度或通过加入简单的盐而容易地实现。在其他情况下,加入多元醇或糖是必须的。溶解后,可以进行细胞分离。获得的澄清流(clarifiedstream)通常太稀以致不能用于配制。可以使用浓缩的步骤,通常用超滤。加入的糖将自由通过超滤膜并变成废物流(wastestream)。所得的浓缩物通常可以被配制进液体产品中。但是其并不总是适于颗粒化。因此,在颗粒化前去除糖是必须的。这可以通过渗滤实现,因此产生了更多的废物。由于加工步骤和废物处理,该方法的影响是显著增加了液体和固体产物的成本。本发明提供了另一种从这一发酵液中经济地产生产品的方式。如今需要颗粒酶制剂,其中酶是不溶解的形式,并且其中不去除细胞和/或不溶解的细胞成分。发明简述本发明提供了用于回收和配制不溶解酶的方法以及含有如本文所述回收和配制的不溶解酶的组合物。在一个方面,提供了一种用于从含有微生物细胞和/或来自微生物细胞的细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶的方法,其包括不去除微生物细胞和/或细胞碎片而从微生物发酵液中回收不溶解酶,因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物,其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。在一个具体实施方案中,提供了用于从微生物发酵液中回收不溶解酶的方法,其包括(a)提供了含有微生物细胞和酶的微生物发酵液,其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的;和
(b)不去除微生物细胞和/或细胞碎片而回收微生物发酵液中的不溶解酶,因而制备了含有回收的不溶解酶的组合物,其中组合物含有微生物细胞和/或细胞碎片。在一些具体实施方案中,不溶解酶是有酶活性的(即酶在固体状态中是有催化活性的,或者具有催化潜能,并且当溶解在合适的溶剂中和在适当的发生催化的条件下变得有催化活性)。在一些具体实施方案中,微生物发酵液通过选自下列的方法产生将酶与含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液混合,其中酶不是微生物细胞产生的且其中酶在微生物发酵液中是不溶解的,或其中酶在微生物发酵液中是可溶的,并且方法另外包括通过加入沉淀剂使得至少一些酶不溶解;向含有用微生物细胞表达的可溶的酶的微生物发酵液中加入沉淀剂,因此引起至少一些酶变得不溶解;和在发酵培养基中的微生物细胞中表达酶,其中至少一些酶在发酵培养基中是不溶解的。在一些具体实施方案中,回收包括至少一种选自下列的回收操作发酵液预处理(conditioning)、细胞裂解、勻浆化、渗滤或固体-液体分离。在一些具体实施方案中,回收包括两种或两种以上选自下列的回收操作发酵液预处理、细胞裂解、勻浆化、渗滤或固体-液体分离,以任何顺序进行。在一些具体实施方案中,回收不溶解酶包括去除至少部分微生物发酵液的液相。在一些具体实施方案中,去除至少部分微生物发酵液的液相包
括浓缩微生物发酵液固体。在一些具体实施方案中,浓缩微生物发酵液包括选自超滤、微量过滤、反向渗透或纳米过滤的膜过滤方法。在一些具体实施方案中,去除至少部分微生物发酵液的液相,例如浓缩微生物发酵液包括选自滚筒真空过滤、板框过滤、带过滤、离心、旋风分离、滗析或蒸发的方法。在一些具体实施方案中,回收不溶解酶包括渗滤。在一些具体实施方案中,微生物发酵液通过在适于表达酶的条件下在生长培养基中表达酶的微生物的生长而产生,其中酶在所述生长条件下是不溶解的。在其他的具体实施方案中,微生物发酵液通过在适于表达酶的条件下在生长培养基中表达酶的微生物的生长而产生,其中酶在所述生长条件下是可溶的,并且其中在回收酶之前加入沉淀剂从而使得至少一些酶在微生物发酵液中不溶解。在一些具体实施方案中,沉淀剂选自调整PH、调整温度、加入盐、加入酸、加入碱、加入至少一种其他蛋白质、加入缓冲液、加入聚合电解质或其组合。在一个具体实施方案中,不溶解酶通过向含有可溶的酶的微生物发酵液中加入沉淀剂,因而使得至少一些酶在微生物发酵液中不溶解而制备,其中沉淀剂选自调整PH、调整温度、加入盐、加入酸、加入碱、加入至少一种其他蛋白质、加入缓冲液、加入聚合电解质或其组合。在一些具体实施方案中,组合物含有回收的含有完整微生物细胞的不溶解酶。在一个具体实施方案中,完整微生物细胞是活的微生物细胞。在另一个具体实施方案中,完整
的微生物细胞是死的微生物细胞。在其他的具体实施方案中,组合物含有回收的含有裂解的微生物细胞的不溶解酶。在一些具体实施方案中,其中表达的酶在微生物发酵液中是不溶解的,所述方法包括在回收不溶解酶之前或之后破坏微生物细胞膜,从而产生微生物细胞裂解液。在其他的具体实施方案中,其中表达的酶在微生物发酵液中是可溶的,所述方法包括在回收被沉淀的酶之前,在加入沉淀剂之前或之后破坏微生物的细胞膜。在一些具体实施方案中,含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液含有微生物细胞裂解液,其通过破坏完整微生物细胞的微生物细胞膜产生。在一些具体实施方案中,破坏微生物细胞膜包括用能够引起微生物细胞裂解的酶与细胞接触。在一些具体实施方案中,能够引起微生物细胞裂解的酶是溶菌酶。在其他的具体实施方案中,破坏微生物细胞膜包括机械细胞膜破坏方法,如勻浆化。在一些具体实施方案中,破坏微生物细胞膜包括机械剪切方法,例如选自勻浆化、高剪切混合、压力挤压或高剪切泵送。在一些具体实施方案中,所述方法另外包括将微生物细胞裂解液勻浆,从而在回收不溶解酶之前或之后产生勻浆的微生物细胞裂解液。在一些具体实施方案中,方法另外包括在回收不溶解酶之前或之后将微生物细胞裂解液渗滤。在一些具体实施方案中,方法另外包括在回收不溶解酶之前或之后将微生物
细胞裂解液勻浆和渗滤。在一些具体实施方案中,微生物细胞是细菌细胞。在一些具体实施方案中,细菌细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞。在一些具体实施方案中,所述芽孢杆菌属细胞是枯草杆菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)细胞。在一些具体实施方案中,微生物细胞是真菌细胞。在一些具体实施方案中,真菌细胞是木霉属(Trichoderma)细胞。在一些具体实施方案中,木霉属细胞是瑞氏木霉(Trichodermareesei)细胞。在一些具体实施方案中,至少约任意10、20、30、40、50、60、70、80或90%的酶在微生物发酵液中是不溶解的。在回收方法的一些具体实施方案中,不溶解酶的纯度增加至少约10%。在另一个方面,本发明提供了根据如本文所述从微生物发酵液中回收不溶解酶的方法产生的组合物,其中所述组合物含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。在一个具体实施方案中,组合物另外含有至少一种制剂成分。在另一个方面,本发明提供了用于产生澄清液体酶溶液的方法,其包括(a)提供含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物,其根据例如如本文所述的从微生物发酵液中回收不溶解酶的方法产生;(b)通过加入一种或多种溶解酶的物质而溶解至少部分不溶解酶,和/或通过改变物理条件以使酶溶解至少一部分,因而制备了可溶的酶溶液;和(c)从步骤(b)中制备的溶液中去除固体,因而制备