乙肝病毒hbv荧光定量pcr检测引物与探针的制作方法.docx

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专利名称:乙肝病毒hbv荧光定量pcr检测引物与探针的制作方法
技术领域:
本发明是一种用于检测乙肝病毒HBV核苷酸序列的的引物和探针。
背景技术:
乙型肝炎病毒(HBV),嗜肝DNA病毒科。,每年有近100万人死于乙肝相关并发症,包括肝硬化、肝细胞癌。我国是乙型肝炎高发区,%的人口过去或现在受到过乙型肝炎病毒的感染,,现症患者已超过2000万人。乙肝病毒携带者中,50%-75%的人有活动性病毒复制的慢性乙肝,估计5年中从慢性乙肝进展为肝硬化的发生率为2%-20%;从代偿性肝硬化到肝脏失代偿为20%-23%;从代偿肝硬化到肝癌为6%-15%。慢性乙肝是进展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的首要危险因素乙肝病毒携带者中,50%-75%的人有活动性病毒复制的慢性乙肝,估计5年中从慢性乙肝进展为肝硬化的发生率为2%-20%;从代偿性肝硬化到肝脏失代偿为20%-23%;从代偿肝硬化到肝癌为6%-15%。HBV的传染性很强,。而乙肝病毒又常常产生突变,这给乙肝的确诊和治疗带来
极大的麻烦,所以迫切需要一种既准确又快速的实验室检验方法来检测乙肝病毒。乙肝病毒的检测技术包括免疫学检测方法,包括酶联免疫分析法,胶体金免疫层析测定法,免疫荧光法和固相放射免疫法;分子生物学检测方法,包括核酸探针法,PCR法和基因芯片法。其中,PCR检测法简便、快速,近年来,在临床检测中备受青睐,但是,普通PCR检测易产生污染。,实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA较传统定性PCR技术操作简便,检测时不需打开反应管便可测出定量结果,从而减少污染机会,同时提高了检测灵敏度、特异性及整个操作的自动化程度。其特异、灵敏且准确等优点,在人类传染病和病原定量上的应用日益广泛。在实时荧光定量PCR检测方法中,引物和探针的设计尤为重要,决定了检测结果的有效性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测HBVDNA的引物和探针。基于上述目的,本发明采用以下技术方案用于检测HBVDNA的弓丨物和探针序列包括上游引物HBVF的序列为5‘TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3‘,下游引物HBVR的序列为5‘GCACAGCTTGGAGGCTTGA3,,探针HBVP的序列为5‘FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3,本发明的原理为在传统的PCR扩增体系中加入一个与靶序列特异互补的双荧光标记寡核苷酸探针,探针的5’端设计了一个报告荧光基团,3’端设计了
一个淬灭荧光基团。在探针完整的情况下,报告荧光基团发出荧光被淬灭荧光基团吸收,此时检测不到荧光信号。当有特异PCR产物时,复性时,标记探针与靶序列结合互补,形成局部双链产生适合于5’-3’核酸外切酶外切活性的底物,激活Tag聚合酶的5’外切酶活性,将5’的荧光分子切除,这样,报告荧光基团与淬灭荧光基团分离,淬灭作用被解除,产生荧光信号,通过荧光定量PCR仪检测荧光度,即可测得最终的定量结果。
利用弓I物对HBVF/HBVR和探针HBVP检测HBVDNA阳性样品的荧光定量PCR图。见附图一。
具体实施例方式1,引物和探针的设计通过分别对所有已知的乙肝病毒基因序列比较分析,选择高保守的区段,设计多对引物和探针,最优的引物和探针如下上游弓丨物HBVF5‘TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3‘下游弓丨物HBVR5‘GCACAGCTTGGAGGCTTGA3,探针HBVP:5'FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3,2,反应体系的优化利用病人血清作为待检样品,分装后储存于_20°,,通过实验结果的分析比较,。,.(MM作倍比连续稀释,通过实验结果的分析比较,去顶最优探针浓度为
,最后确定,HBVDNA荧光定量PCR的最优体系为40μL。,具体按照仪器使用说明书进行设置。4,PCR反应条件如下370C5min,1个循环;95°C2min,1个循环;95°C10sec,59°C40sec,40个循环。在59°C40sec阶段收集荧光。5,检测结果分析如果待检样品中HBVDNA,则显示阳性扩增曲线,检测灵敏度为100拷贝/mL。如果待检样品中没有HBVDNA,则没有信号。显示上述引物和探针有良好的特异性和检测灵敏度。本发明的优点在于(1)由于我国乙肝病毒多为B和C型,故市场上同类产品基本只针对这两型。而本发明提供的引物和探针,是选取了乙肝病毒已知的所有亚型的高保守区域,可以达到所有亚型都能检出的效果。并能避免假阴性结果的出现。(2)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度达到300拷贝/mL,显示了其将具有很好的检出率。(3)本发明提供的引物和探针检测阴性样品没有信号,显示了其很好的特异性。
权利要求
一种用于检测乙肝病毒基因(HBVDNA)的引物,其特征在于所述的引物序列包括上游引物HBVF5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′,下游引物
HBVR5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’。
(HBVDNA)的探针,其特征在于所述的探针HBVP序列为5‘FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’。
全文摘要
一种用于检测HBVDNA的引物与探针,引物序列包括上游引物HBVF5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′下游引物HBVR5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’探针序列HBVP5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’。