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检测致病曲霉菌的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒的制作方法
本发明公开了一种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒,序列如下:上游引物序列如序列1所示,下游引物序列如序列2所示,所述荧光探针序列如序列3所示。本发明为了克服传统的临床致病曲霉菌检测的缺点和局限性,开发一种快速、灵敏、特异的检测致病曲霉菌的检测试剂盒,能用一个反应同时检测4种常见致病曲霉菌,且具有较高的灵敏度和特异性。
【专利说明】检测致病曲霉菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】,尤其是一种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002]临床常见的深部真菌感染多见于念珠菌、曲霉菌、新型隐球菌等,其中念珠菌属感染最多,其次为曲霉菌感染,且侵袭性曲霉菌感染率正逐年升高,病死率较高,其感染患者的存活主要依赖于早期诊断和早期治疗。传统的实验室诊断方法耗时太长,耽误时间的同时恐错过最佳治疗时机,同时敏感性较低,因此
从技术上解决这一问题颇为重要。
[0003]目前,临床上常用的深部真菌诊断方法有:传统培养法、影像学检查法、血清学检查。以上方法均存在一定的缺陷:传统培养法是诊断真菌感染的最直接方法,准确度高,但其耗时长、易污染、敏感性低的缺点使其不利于临床患者诊断;影像学检查通过高分辨率的机器对患者病灶部位直接进行动态观察,具有重要的提示价值,但此方法不仅特异度低且仅对高危病人具有早期诊断价值;血清学方法具有一定的敏感度和特异性,但诊断的假阳性率较高。
[0004]目前相对最为先进、也最有发展前景的是分子生物学方法,即PCR,聚合酶链式反应方法。传统的PCR技术虽具有较高的灵敏度,但特异度低,因外源污染等问题容易造成假阳性结果。实时荧光定量PCR技术能够在极短的时间内检测出组织中极微量的真菌DNA,具有较高的灵敏度和特异性。
[0005]患者感染的侵袭性曲霉菌病中有95%以上是由烟曲霉、黄曲霉、土曲霉及黑曲霉这四种常见致病曲霉菌感染造成,目前文献报道中有用多条探针鉴定到种的,首先对于临床上侵袭性曲霉菌病的诊断无需鉴定到种,只需鉴定到曲霉菌属便可采取相应的治疗方法进行抗真菌治疗;其次,多条探针共存于同一荧光定量PCR体系,多重荧光PCR条件摸索繁琐且相互间或有一定影响;另外,TaqMan荧光探针价格较高,使得试剂盒成本大大的增加。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒,本发明借助相同引物与TaqMan探针,建立一种能够同时检测4种主要致病曲霉菌(烟曲霉、黄曲霉、土曲霉及黑曲霉)的荧光定量PCR检测方法具有较高的灵敏度和特异性,对于侵袭性曲霉菌病的早期诊断和治疗具有重大意义。
[0007]本发明实现目的的技术方案如下:
[0008]-种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR引物,序列如下:
[0009]上游引物序列如序列1所示,下游引物序列如序列2所示。
[0010]一种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR探针,所述荧光探针序列如序列3所示。
[0011]一种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR试剂盒,包括权利要求1所述的引物,包括如权利要求2所述的探针。
[0012]而且,所述试剂盒设有内参照质控,其引物和特异性检测探针序列如下:
[0013]上游引物序列如序列4所示,下游引物序列如序列5所示,荧光探针序列如序列6所示。
[0014]本发明取得的优点和有益效果是:
[0015]1、本发明为了克服传统的临床致病曲霉菌检测的缺点和局限性,开发一种快速、灵敏、特异的检测致病曲霉菌的检测试剂盒,能用一个反应同时检测4种常见致病曲霉菌,且具有较高的灵敏度和特异性。
[0016]2、本试剂盒同时加入了内参照质控,全程监控核酸提取和荧光PCR检测过程,最大限度的避免了临床检测污染(假阳性)的发生,双通道检测结果准确度更高更可靠。
[0017]3、本发明通过自主设计检测曲霉菌的特异性探针和引物序列,能够同时检测烟曲霉、黄曲霉、土曲霉及黑曲霉4种临床常见致病曲霉菌,经实验验证具有较高的灵敏度和特异性,整个检测过程仅需2-3个小时,相比传统检测方法不仅效率大大提高,而且敏感度及特异性都有了极大的改进。
[0018]4、本发明的试剂盒使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶和dUTP,有助于避免扩增产物的污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为荧光定量PCR的特异性结果图;
[0020]图2为本试剂盒荧光定量PCR检测的灵敏度结果图;
[0021]图3为荧光定量PCR检测灵敏度实验内参照通道结果图;
[0022]图4显示对已确诊患者标本FAM通道检测曲线,同时设阴性对照与阳性对照;
[0023]图5显示对已确诊患者标本内参照通道检测曲线,同时设阴性对照与阳性对照。
【具体实施方式】
[0024]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
[0025]本发明提供的一种曲霉菌检测试剂盒,由PCR反应液管、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、阳性对照品管、阴性对照品管、内参照和盒体组成。PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、特异性引物各200nM、荧光标记的探针IOOnM组成;阴性对照为无核酸酶污染的去离子水;阳性对照为具有目的检测序列的DNA插入到pMD-T载体而构成的重组体;内参照为酿酒酵母菌菌体冻干粉。
[0026]阳性对照插入的目的检测基因序列为:
[0027]GAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCG
[0028]构成本试剂盒的核心即检测常用致病曲霉菌的引物和特异性荧光探针,序列分别如下:
[0029]上游引物序列:5'-ATGCCTGTCCGAGCGTCAT-3'
[0030]下游引物序列:5'-GTATCCCTACCTGATCCGAGGTC-3'
[0031]荧光探针序列:5'-FAM-CCTCGAGCGTATGGGGCTTYGT-TAMRA-3'
[0032]另外,本试剂盒设有内参照质控,其引物和特异性检测探针序列如下:
[0033]上游引物序列:5'-GCTGTCATCGGTTACTTAGAITTAG-3'
[0034]下游引物序列:5'-CCCTTCTTCTTTAGCAGCAATG-3'
[0035]荧光探针序列:5'-VIC-CGATGITGCTGITITGCCAITITCCA-TAMRA-3,
[0036]本发明所述试剂盒的使用方法为:
[0037]⑴荧光PCR反应体系如下所示:
【权利要求】
,其特征在于:序列如下:上游引物序列如序列1所示,下游引物序列如序列2所示。
2.-种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR探针,其特征在于:所述荧光探针序列如序列3所示。
3.-种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述的引物,包括如权利要求2所述的探针。
,其特征在于:所述试剂盒设有内参照质控,其引物和特异性检测探针序列如下:上游引物序列如序列4所示,下游引物序列如序列5所示,荧光探针序列如序列6所/_J、i〇