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与小麦千粒重相关的基因、功能标记及其应用的制作方法
、-4A-caps及该标记的应用。-4A-caps标记引物对待测小麦品种DNA进行PCR扩增,扩增产物用SalI内切酶进行酶切,将产物电泳分离,如PCR产物为793bp和316bp的两条带,则该小麦品种为具有该基因高千粒重单倍型的品种;如PCR产物只有一条大小为1106bp的带,则该小麦品种为不具有该基因高千粒重单倍型的品种。,可以便于检测和筛选具有高千粒重的小麦品种或品系,可大大加快小麦高产品种的选育进程。
【专利说明】与小麦千粒重相关的基因、功能标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域,具体地说是一种与小麦千粒重相关的基因、分子标记及其应用
【背景技术】[0002]小麦是世界上最重要的粮食作物之一,因此选育高产小麦品种一直被育种家高度重视。研究证明,主要受籽粒大小性状影响的千粒重是最稳定的产量直接构成因素,小麦的千粒重每增加lg,每公顷小麦的产量将增加140-160kg()。可见,提高小麦千粒重以增加产量是小麦最重要的育种目标之一。
[0003]功能标记是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发出来的一种新型分子标记,是来源于控制表型的基因序列内部,在鉴别基因序列的表型功能后,挖掘该序列中的多态性信息及对应序列的表型效应,从而开发出能够区分和预测(复)等位基因及相对性状的DNA标记(AndersenJRandLbberstedtT2003)。由于功能标记来自基因内的功能性基序,不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下确定目标等位基因的有无,因此在作物遗传育种的研究应用中较传统分子标记更具高效、便捷等优势。
[0004]蔗糖非酵解型蛋白激酶是广泛存在于植物中的一类Ser/Thr类蛋白激酶,分为SnRKUSnRK2和SnRK3三个亚家族。其中SnRK2家族基因在植物脱落酸信号转导、渗透胁迫响应、气孔开闭、矿质营养吸收以及生长发育过程中具有重要作用()。将小麦的SnRK2家族成员转化拟南芥进行功能研究,结果表明,该基因家族成员能显著提高转基因拟南芥的抗逆性,同时改善转基因植株的碳水化合物和能量代谢,调节植株生长发育和生量的积累(;;)。因此,SnRK2基因家族成员可能具有影响小麦千粒重,提闻小麦广量的潜在价值。目如,尚未有关于该基因家族成员影响小麦千粒重的研究报道。
[0005]因此,克隆与小麦千粒重相关基因SnRK2,开发相关的功能标记,进行单倍型分析,并与千粒重性状进行关联分析寻找优异的单倍型,对于提高小麦千粒重、获得高产小麦新品种具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0006]、与所述基因相关的功能标记开发及其应用,通过该功能标记对待测小麦品种或品系的DNA进行PCR扩增,可以快速筛选出具有较高千粒重的小麦材料。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0008],-4A、--4D;-4A的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO:I所示、gDNA核苷酸序列如SEQIDNO:4所示,-4B的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO:2所示、gDNA核苷酸序列如SEQIDNO:5所示,-4D的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO:3所示、gDNA核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
[0009]:
[0010]1、:(1)以NCBI提交的水稻SAPKlO(Accession:AB125311)基因序列为探针,搜索小麦
EST数据库,将得到的序列用DNAMAN软件拼接,对开放阅读框进行预测,;(2)--2,。
[0011]2、利用Trizol试剂盒法提取总RNA:(I)磨碎叶片;(2)将磨碎的叶片加入到盛有Trizol试剂的离心管中,混匀,放置片刻;(3)在4°C下离心,取上清,加入到一个新的无RNase的离心管中;(4)在新的离心管中加入***仿,震荡,放置后,再离心;(5)取上层水相至,,将得到的溶液转移到吸附柱中,离心lmin,弃废液;(6)向吸附柱中加入500μI去蛋白液RD,离心lmin,弃废液;(7)向吸附柱中加入漂洗液RW,静置后,离心,弃废液;重复一次。(8)将吸附柱离心,去掉残余液体,将吸附柱晾干;
(9)将吸附柱转入一个新的离心管中,加入RNase-freeddH20,室温后,离心,得到的液体即为RNA。
[0012]3、利用改良CTAB法提取DNA:(I)将叶片磨成细粉;(2)加入CTAB提取液,震荡温育;(3)置于低温下加入酚和***仿,离心;(4)取上清液,加入***仿-异戊醇混匀,离心20;
(5)取上清液,加入冰异丙醇,混匀,带核酸沉淀出现,离心;
(6)弃上清液,用乙醇洗涤沉淀两次;(7)弃乙醇,吹干DNA,用250μIIXTE溶解DNA,加入RNase,水浴去除RNA,即得DNA;
`[0013]4、利用反转录试剂盒进行第一链cDNA序列合成:在离心管中加入总RNA、oligodT引物(50μΜ)、dNTP混合物,将样品置于65°C5min用于打开RNA的二级结构,迅速冷却,瞬时离心后加入5x反应缓冲液,RNA酶抑制剂,反转录酶,无RNA酶ddH20,混匀,待反应终止,稀释后保存于冰箱备用;
[0014]5、聚合酶链式反应(PCR)反应进行序列扩增:--2引物分别对小麦cDNA和gDNA进行PCR扩增,将扩增产物保存;
[0015]6、PCR产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收:(I)柱平衡;(2)将单一的目的DNA条带切下置于离心管中,称重;(3)向胶块中加入等倍体积溶液PC,水浴放置片刻,使之充分溶解;(4)将所得溶液加入吸附柱CB2中,将吸附柱CB2放入收集管中;(5)向吸附柱CB2中加入漂洗液PW,将吸附柱CB2放入收集管中;(6)重复操作步骤5;(7)将吸附柱CB2放入收集管中,离心,除去漂洗液;将吸附柱晾干;(8)将吸附柱CB2放入离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB,室温离心,收集DNA溶液。
[0016]7、基因克隆:取4PCR回收产物加入与pEASY-Tl载体,混合,室温反应,完成连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5α
菌株,在表面涂有IPTG,X-gal的氨苄青霉素LB平板生长过夜;挑选白色菌落,通过快速PCR挑选阳性克隆测序;
[0017]8、-4A、--4D序列分析:(I)--2引物进行PCR扩增,分别得到3条全长cDNA序列和对应的gDNA序列,根据序列差异设计基因组特异引物,-4A1、--4D1扩增中国春缺四体DNA进行染色体定位,3条序列分别定位在4A、4B和4D基因组上;(2)运用DNAman软件对测序结果进行分析,--4A的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示,分子量为1339bp、-4B的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示,分子量为1342bp、-4D的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示,分子量为1284bp;分别包含一个长为1086bp的开放阅读框,编码361个氨基酸;--4A的gDNA核苷酸序列如SEQIDNO:4所示,其分子量为2080bp、-4B的gDNA核苷酸序列如SEQIDNO:5所示,-4D的gDNA核苷酸序列如SEQIDNO:6所示,其分子量为2029bp,分别包含8个外显子和7个内含子;(3)、--4D和水稻氨基酸同源性,-4A、-4B
-4D与水稻SAPKlO氨基酸序列具有很高的同源性,氨基酸序列一致性达到95%以上,该基因是小麦千粒重的功能基因。
[0018]--2;
[0019]-1
[0020]正向引物序列GCTTGCTCGGTTGCTTTGC(如SEQIDNO:7所述),
[0021]反向引物序列CATCCAAAAGGCCAAACCGT(如SEQIDNO:8所示);
[0022]-2引物
[0023]正向引物序列GTCAAGTACATCGAGCGAGGG(如SEQIDNO:9所述),
[0024]反向引物序列CGTCGTTCAGGAACTGGTTGA(如SEQIDNO:10所述)。
[0025]-4A1,--4D1;
[0026]-4A1的
[0027]正向引物序列CTTCATTCGCAACCAAAATCTACG(如SEQIDNO:11所述),
[0028]反向引物序列GAACTGGTTGATCCGAGAACGG(如SEQIDNO:12
所示);
[0029]-4B1的
[0030]正向引物序列TGCTTGCTTCACTGTCGCAG(如SEQIDN0:13所述),
[0031]反向引物序列GCAGAGTCTAGCAGTACCGTT(如SEQIDNO:14所述);
[0032]-4D1的
[0033]正向引物序列CCATGACGTTCTCCGTTCCC(如SEQIDN0:15所述),
[0034]反向引物序列GCACACTCAATATCCTCTGGC(如SEQIDNO:16所述)。
[0035]-4A_caps,其所述分子标记的引物
[0036]正向引物序列CTTCATTCGCAACCAAAATCTACG(如SEQIDNO:11)所述,
[0037]反向引物序列GAACTGGTTGATCCGAGAACGG(如SEQIDN0:12)所述。
[0038]-4A_caps检测小麦品种千粒重的方法,包括以下步骤:
[0039]-4A_caps的标记引物对小麦品种的DNA分别进行PCR扩增,其PCR扩增体系为20μ1,,,,左反向引物各
,,;扩增条件为94°C预变性4min;94°C变性40s,58°C退火45s,72°C延伸lmin,35个循环;72°C延伸IOmin;10°C保存。[0040],酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离,如PCR扩增产物被切开大小为793bp和316bp的两条带,则该小麦品种属于具有高千粒重纯合体品种;如PCR产物被切开为793bp和316bp的带,同时具有未切开的1106bp大小的带,则该小麦品种属于具有高千粒重的单倍型的杂合体品种;如PCR扩增产物只有一条未切开的大小为1106bp的带,则该小麦品种属于不具有高千粒重的纯合体品种;其中SalI内切酶体系为20μ1,包含SalI内切酶Iμ1,IOX缓冲液2μ1,PCP产物17μI;反应条件为37°C,5min。
[0041],该基因在不同的小麦品种中存在紧密连锁的3个SNP位点和一个InDel位点,表现为两种单倍型,将单倍型与千粒重性状进行关联分析,发现两种单倍型与小麦千粒重显著相关;基于上述,-4A_caps,通过该分子标记对小麦DNA进行PCR扩增,可以快速检测和筛选出具有较高千粒重的小麦品种或品系。
[0042],基于该基因开发的分子标记应用于小麦育种,不仅筛选快速精准,不受环境影响,选择目标明确,而且节约了生产成本,大大提闻了闻广小麦品种或品系的选择效率和质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]-4A、--4D与水稻SAPKlO的
氨基酸序列比较。
[0044]-四体的定位结果。01:山农0431;02:鲁麦21;03:N4AT4B;04:N4BT4A;05:N4DT4B;06:水。
[0045]图3为开发SNPmarker不意图。M:marker;01:鲁麦21号;02:中国春;03:烟农15号;04:济南17号;05:小偃81;06:济宁17号;07:山农0431;08:山农8355;09:鲁麦23号;10:潍麦8号。
[0046]-4A_caps标记检测以小麦品系山农0431为亲本的F7代RIL群体的13个衍生品系的结果。
【具体实施方式】
[0047]以下结合实例,对本发明进行详细说明:
[0048]实施例1
[0049],使用的材料为鲁麦