与乙烯合成相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法.docx

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专利名称:与乙烯合成相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及ー种与こ烯合成相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术:
香蕉是ー种典型的呼吸跃变型果实,对香蕉果实成熟机理的分子生物学研究将有助于发展建立在基因表达调控基础上的采后保鲜新技术,完善对果实成熟调控研究的深入,这些研究在香蕉产业发展中具有重要的理论和实践意义。こ烯是香蕉采后成熟的核心,与大多数的跃变型果实不同,香蕉果实在呼吸跃变的过程中こ烯的释放速率的升高和降低是剧烈的,因此认为香蕉中こ烯生物合成的调节机制可能与其它跃变型果实不同。氨基环丙烧羧酸(l-aminocyclopropane-1-carboxylicacid,ACC),氧化酶基因(1-aminocyclopropane-l-carboxylicacidoxidase,AC0)是在成熟度II开始表达并持续到随后的成熟度,该ACO基因可以被外源こ烯所诱导。Liu等对香蕉成熟过程中的ACS、AC0基因表达及与成熟之间的关系进行了较为系统的研究。他们的研究结果表明,在自然成熟果实的跃变启动期,其中ー个ACS(MA-ACSl)的表达增强,伴随着こ烯的迅速增长,而随后就迅速降低。而在跃变启动时期,
ACO活性被大量激活,随后也迅速降低。在跃起变前可以检测到ACO基因的表达(MA-AC01),而且随后的成熟过程中仍然维持着高水平的表达,尽管此时ACO的活性已经降低了。这种结果的差异是由于ACO活性所需的各种因子含量降低。他们的结果说明,香蕉成熟过程中的こ烯生物合成在跃变上升之前是受MA-ACSl转录水平调节的。在大多数呼吸跃变型果实后熟过程中こ烯的产生与呼吸速率成正比,而在香蕉果实后熟跃变前早期,有一个短而又突出的こ烯高峰,然后下降,而MA-ACSl的转录和ACC的含量依然很高,所以ACS和ACC不是此时こ烯产生的限制因素。
发明内容
本发明的ー个目的是提供ー种蛋白。本发明提供的蛋白,是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码所述蛋白的基因也是本发明保护的内容。上述基因是如下(I)-(4)中任--种的DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子;(2)序列表中序列I自5’末端第1-1140位核苷酸所示的DNA分子;(3)在严格条件下与
(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子;(4)与(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述严格条件为在6XSSC,%SDS的溶液中,在65°C下杂交,然后用2XSSC,
%SDS和IXSSC,%SDS各洗膜一次。含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的内容。上述重组载体为将序列表中序列I自5’末端第1-1140位核苷酸插入PCAMBIA1304载体的NcoI和SpeI酶切位点间得到的载体。扩增上述基因的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围;上述引物对由序列表中的序列3所示的DNA分子和序列表中的序列4所示的DNA分子组成的。上述蛋白、上述基因和/或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物中こ烯生物合成和/或促进植物果实成熟中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中,所述调控植物中こ烯生物合成为促进植物こ烯生物合成;所述促进植物こ烯生物合成通过提高植物果实こ烯释放量体现。上述蛋白、上述基因和/或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物果实こ烯释放量、促进植物果实成熟和/或调节植物果实大小中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中,
所述调控植物果实こ烯释放量为提高植物果实こ烯释放量;所述调节植物果实大小为增大植物果实。本发明的另ー个目的是提供ー种培育转基因植物的方法。本发明提供的方法,为将上述蛋白的编码基因导入目的植物中,得到转基因植物;所述转基因植物具有如下至少ー种特征I)所述转基因植物的果实大于所述目的植物;2)所述转基因植物果实こ烯释放量大于所述目的植物。上述方法中,所述蛋白的编码基因通过上述的重组载体导入目的植物中;上述方法中,所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物;所述双子叶植物为番茄。本发明的实验证明,本发明发现了ー种新的MaADHl基因,器官特异性表达分析表明香蕉MaADHl在根、茎、叶、花中都不表达,只在果实中特异表达,将其转入番茄中,得到转基因番茄,其果实大于野生型番茄,且果实的こ烯释放量有明显提高,表明该基因在香蕉果实采后成熟过程中可能起着调控こ烯生物合成和果实采后成熟的相关作用。
图I为香蕉MaADHlcDNA5’端序列电泳结果图2为香蕉MaADHlcDNA3’端序列电泳结果图3为pCAMBIA1304_MaADHl载体PCR验证
图4为转MuMADS2番茄株系全基因组DNAPCR检测图5为野生型和转基因番茄果实大小图6为转基因番茄果实こ烯含量測定图7为MaADHl在不同香蕉器官中的表达图8为こ烯处理,
I-MCP处理后MaADHl的荧光定量结果图9为ABA和AOAA处理后MaADHl的荧光定量结果
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例I、MaADHl基因的获得一、香蕉MaADHl的cDNA的获得提取香蕉(,购自中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园)果实的RNA,反转录得到cDNA作为模板,按照如下体系进行PCR扩增以cDNA文库库液作为模板,以A2Q3’和A2_3’作为引物扩增,结果如图I所示,其中,左为半嵌套PCR第一轮扩增,右为第二轮扩增,1,3marker;2:第一轮PCR产物;4■第二轮PCR产物,得到IOOObp5’端PCR产物;以cDNA文库库液作为模板,以A2Q5’和ptr3’作为引物扩增,结果如图2所示,其中,Imarker;2:PCR产物,得到400bp3,端PCR产物;再以cDNA文库库液作为模板,以24-5’引物和24_3’引物为引物,按表I的PCR反应体系,表2的PCR反应程序扩增得到1400bpPCR产物。引物如下根据SSH获得的基因片段,用PrimerPremier5设计三条引物,交由上海生物エ程有限公司合成。其中A2Q3,和A2-3,是5,-RACE引物,A2Q3’是外引物,A2-3’是内引物;A2Q5,是3,-RACE引物。A2Q3,5,—GAGAACGGCACGGAATGGGTAATG—3
,;A2-3’5’-GCACCATAACCTGTCGATATACCG-3’;A2Q5’5’-TCATTACCCATTCCGTGCCGTTCTC-3’。文库的接头引物为ptr5’5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’;ptr3,5,-TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3,。24-5’引物5’-GAGAAGGAGCGGAAGAGATGT-3’24-3,引物5,-CAGTAACTCGTCTAGCCATCCAT-3,
权利要求
,是如下(a)或(b):Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。
。
,其特征在干所述基因是如下(I)-(4)中任一一种的DNA分子(1)序列表中序列I所不的DNA分子;(2)序列表中序列I自5’末端第1-1140位核苷酸所示的DNA分子;(3)在严格条件下与(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子;(4)与(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%
同源性编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
。
、权利要求2或3所述基因和/或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物中こ烯生物合成和/或促进植物果实成熟中的应用;所述调控植物中こ烯生物合成具体为促进植物こ烯生物合成;所述促进植物こ烯生物合成进ー步具体通过提高植物果实こ烯释放量体现。
、权利要求2或3所述基因和/或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物果实こ烯释放量、促进植物果实成熟和/或调节植物果实大小中的应用。
,其特征在于所述调控植物果实こ烯释放量为提高植物果实こ烯释放量;所述调节植物果实大小为增大植物果实。
,为将权利要求I所述蛋白的编码基因导入目的植物中,得到转基因植物;所述转基因植物具有如下至少ー种特征1)所述转基因植物的果实大于所述目的植物;2)所述转基因植物果实こ烯释放量大于所述目的植物。
,其特征在于所述蛋白的编码基因通过权利要求4所述的重组载体导入目的植物中;所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物;所述双子叶植物为番茄。
全文摘要
本发明公开了一种与乙烯合成相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白,是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明的实验证明,本发明发现了一种新的MaADH1基因,器官特异性表达分析表明香蕉MaADH1在根、茎、叶、花中都不表达,只在果实中特异表达,该基因在香蕉果实采后成熟过程中可能起着调控乙烯生物合成和果实采后成熟的相关作用。