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专利名称::植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域:
:本发明涉及植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用,特别涉及一种来源于拟南芥的植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术:
:干旱是非生物胁迫中限制作物产量的主要因素,由于干旱而导致的作物损失量超过其他逆境造成损失的总和。随着人类的经济发展和人口膨胀,水资源短缺现象日趋严重,这也直接导致了千旱地区的扩大与干早化程度的加重,干旱化趋势已成为全球关注的问题。因此,了解和认识植物对干旱胁迫的反应机制,进而提高植物特别是农作物的抗旱能力,已成为如何进一步提高作物产量的重要研究工作,倍受世界各国政府和科学家的关注,也是当前生命科学研究的热点。拟南芥C^a&amp;'f/opw'st力ah'a朋)是一种典型的模式植物(其作用与实验鼠、果蝇等模式生物相当),已被广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。,。目前大部分基因的功能还不清楚,利用突变技术研究基因功能已经成为一种有效的方法。对拟南芥而言,T-DNA插入突变是主要途径,并且己经得到大量
T-DNA插入突变体。拟南芥的大多数基因在其他植物中都能找到与之同源的序列,有关拟南芥的绝大多数发现也都能应用于其他植物研究。以往的研究已经证明,对拟南芥的研究将帮助科学家找到提高农作物产量的方法。面对农作物生产中日益严重的土壤干旱问题,克隆植物耐旱基因并对其功能进行研究,对尽快培育作物耐干旱品种有重要的实践意义。
发明内容本发明的目的是提供一种植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的植物耐旱性相关蛋白,名称为AtDT-2(^^&amp;VoAsAz^"'朋aDroughtTolerance),来源于拟南芥属拟南芥(AraWopw\st力a〃朋a),是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐旱性功能的由(a)衍生的蛋白质。其中,序列表中的序列2所示的蛋白序列由545个氨基酸残基组成。为了使(a)中的AtDT-2分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定,可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列,为了(a)中的AtDT-2便于纯化,可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。(b)中的AtDT-2可人工合成,也可先合成其编码基因,再按照下述方法进行生物表达得到。上述
(b)中的AtDT-2的编码基因可通过将序列表中序列1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5'端连上信号肽的编码序列,和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的编码序列得到。上述植物耐旱性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。上述植物耐旱性相关蛋白的cDNA基因,可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW:1的核苷酸序列;2)编码框为序列表中SEQIDJN"2:1的5'端第227_1864位核苷酸序列的多核苷酸;3)在高严谨条件下可与l)或2)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。其中,序列表中序列1是由2568个脱氧核苷酸组成,自序列表中序列1的5'端第227—1864位核苷酸序列为编码序列(ORF),编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。上述植物耐旱性相关蛋白的基因组基因,可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW2:3的核苷酸序列;2)序列表中SEQIDW2:3的核苷酸序列;3)在高严谨条件下可与1)、2)或3)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。(),%SDS的溶液中,在65°C下杂交并洗膜。含有上述植物耐旱性相关蛋白的编码基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。利用可以引导外源基因在植物中表达的载体,将本发明所提供的
^t"71-^基因导入植物细胞,或将Jtzr-2基因过表达,提高了转基因植株对干旱的耐受能力。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所使用的载体进行加工,如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物,也可以是双子叶植物。本发明的耐旱基因对于植物耐干旱分子机制的研究,植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义。图l为拟南芥突变体6^^W)的插入突变基因的鉴定结果;图2为干旱条件下拟南芥突变体(&amp;^:—^X^W)的表型分析结果;图3为gus染色方法进行^tzr^基因表达定位结果图4为^tzr-^在不同组织部位的表达结果图5为A"7-2基因在A"71-i"基因过量表达植株(0E)、突变体5^A一Mi^W和5^7A—0^"7恢复突变植株(COM)中的表达RT-PCR结果;图6为野生型(Columbia型)、突变体仍%^0、过量表达植株(0E2)及突变体&amp;7Lft^4W恢复突变植株(COM2)四种材料干旱处理表型分析;图7为野生型(Columbia型)、突变体(5"a7A—0《2^7)、过量表达植株(0E2)及突变体feA—ft^W7恢复突变植株(COM2)四种材料干旱处理土壤相对含水量变化结果;图8为野生型(Columbia型)、突变体(5aM—做"^)、过量表达植株(0E2)及突变体&amp;7々_0^^^恢复突变植株(COM2)四种材料干旱处理离体叶片失水速率结果。具体实施例方式实施例l、植物耐旱性相关的基因及其编码蛋白的获得一、
Columbia背景的对耐早性敏感的拟南芥突变体的获得从ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)购得到编号为Salk—082441的T-DNA插入突变体L代种子(简称突变体Salk—082441),该编号为Salk—082441的T-DNA的纯合突变体在土壤干旱条件下表现为较野生型(Columia型)敏感症状。1、Salk一082441进行T-DNA插入的纯合体获得和鉴定首先对Salk—082441进行T-DNA插入的纯合鉴定。利用http:〃.html网站进行弓l物设计。突变体Salk—082441中T-DNA插入突变体的获得是通过载体pBIN-pR0K2将携带的T-DNA揷入到目的基因,从而导致目标基因功能丧失。Salk—082441T-DNA插入突变体的鉴定需要3条引物,分别是LP、RP和Lbal。其中LP、RP为^W7-i"基因组上的序列,Lbal为T-DNA插入左边界的序列,三条引物的序列分别为LP:5,-ccaacaatccgactcagaa~3,RP:5'-atcctgatccgactaagcg-3,Lbal:5,-tggttcacgtagtgggccatcg-3,。分别以LP/RP和Lbal/RP为引物对,以T-DNA插入突变体基因组DNA为模板进行PCR扩增,鉴定表明上述^^WJ的T-DNA插入突变体L代种子为纯合的T-DNA插入突变体&amp;^L6拟南芥属拟南芥(AraZ油A^'s"ah'扁)〈400〉1tctctccccccggcgtccattccttgatctcgcctgtgtatcg卿tcggtgttctcaaaaggtcgtg^ccacgaagctcgaagacgttt^gctta^gagctgttgcgtcgagatttgggc
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