文档介绍：大蒜SOD
大蒜中超氧化物歧化酶的提取及其酶活力测定
一、实验目的:
⒈掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
⒉了解酶在提取过程中的两个参数:回收率、纯化倍数。
⒊掌握离心机的使用。
二、实验原理:
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间,生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅,即酶活力越大,颜色越浅。
三、实验材料及试剂:
大蒜、磷酸缓冲液(, )、氯仿—乙醇混合液、冷丙酮、邻苯三酚(焦性没食子酸)、浓盐酸
四、操作步骤:
1、SOD提取:称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞, ,研磨搅拌20分钟,使SOD充分溶解,6000rpm离心,弃去沉淀,得上清液。(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)
2、除杂蛋白:提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10分钟,6000rpm离心15min去沉淀,得粗酶液。(取1ml粗酶液备用,精确测量剩
余粗酶液体积)
3、SOD酶的沉淀分离:剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮,搅拌15min,6000rpm离心15min,得到SOD酶沉淀。将沉淀每管先加2ml磷酸缓冲液,溶解后在加3ml混匀。6000rpm离心15min,取上清得到SOD酶液。取1ml备用,其余量取体积。
4、粗酶液活性测定(邻苯三酚法)
提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测,具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应,420nm测吸光值. 5、溶液中可溶性蛋白含量测定:
分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度. 提取液稀释:50 × 粗酶液稀释:20 × 酶液稀释:10 ×
蛋白质浓度(mg/ml)=( – ) ×稀释倍数 6、计算:
酶活力单位U/ml=2(OD1-OD2)×5/
(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度
纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力五、实