文档介绍：实验五-大蒜SOD制备
实验五制备大蒜SOD
实验申请
实验题目:
实验原理: 利用丙酮沉淀法,从大蒜汁中分离提取SOD
实验原料:新鲜蒜瓣约20g
实验仪器:离心机
超声波细胞破碎
分光光度计
辅助仪器:电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等
实验试剂:50mM NaPi buffer ( ) (+)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙
酮、活性测定缓冲液
参考书目:
[1] 李永利,[J].中国卫生检验2000,12,10(6):673
[2] 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究[J].,(10):23~25
[3] 邹芝芳, 的对比研究[J].食品科学2004,34(5)
[4] 张丽,罗丽萍, 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性[J].,24(4)
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实验记录
操作记录:制备大蒜SOD 操作说明及结果记录:
校正天平后,取新鲜蒜瓣 20g
↓可以数组合并进行。
组织捣碎机处理10min。
↓合并破碎者,需要先分
开,再进行相关操作。
加入50mM NaPi buffer ( ) (+)
150ml 磷酸缓冲液,搅拌均匀。
↓
超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴)
↓搅拌浸提10min
先用纱布过滤,再用漏斗过滤,得滤液
↓60℃热变性20min
过滤或离心去除沉淀,得上清液,测体积V1。
↓
另取适量体积的(20ml)滤液,加2 倍体积的
氯仿-乙醇(3:5),于分液漏斗中振荡5min。
↓
分离上层水相,加入等体积的预冷丙酮。
↓搅拌15 分钟,使沉淀完全。
4000rpm,15min 离心,收集沉淀
↓注意先称离心管质量
将沉淀称重,得产品,计算收率。
部分沉淀用活性测定缓冲液溶解,用于
SOD 活性检测,计算总的酶活与得率。
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实验结果与分析数据整理:
1、空离心管质量:
第①组 第②组 粗体物与容器质量:
第①组 第②组 产品质量:
第①组 -= 第②组 -=
2、冰丙酮沉淀SOD
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冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀,在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。
3、邻苯三酚自氧化抑制标准曲线制作
邻苯三酚自氧化速率测定表1:
试剂
Tris-HCl 100mmol/L
ddH2O
邻苯三酚3mmol/L(用10mmol/L HCl配
制)
测量管
空白管
酶活力测定表2:
ddH2O 酶溶液
邻苯三酚3mmol/L(用10mmol/L HCl配
制)
吸光度测定数据: 浸提温度条件:室温
时间
邻苯三酚自氧化
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吸光度
酶活抑制邻苯三酚自氧化
由于0-3s之间的吸光值与时间基本符合线性关系,所以去0-3s间数据做曲线得:
邻苯三酚自氧化标准曲线方程:y=+ R2=
酶活抑制邻苯三酚自氧化方程:y=+ R2=
邻苯三酚自氧化速率A0=
加入SOD后邻苯三酚自氧化速率A=
SOD活性(μ/ml)=(A0-A)/A0?100%反应体积??稀释倍数 50%样品体积
(-)/?100%9??50= 50%2 =
数据分析:
从标准曲线上可以看出加入SOD的吸光度直线斜率略小于未计入酶溶液之前,说明SOD对邻苯三酚自氧化现象有抑制作用。但从实验结果分析