文档介绍：实验二__小鼠脾细胞提取及计数
实验二小鼠脾细胞提取及计数
一、介绍本次实验整体情况(8:00-8:05,5分钟):
本次实验的操作包括三部分:包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。
ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。
二、包被和封闭ELISA板:
备注:提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂
1. 讲解内容(8:05-8:15,10分钟)
包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验(ELISA)做准备。
包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。在ELISA 板上加上抗原以后,因为电荷数与板不同,所以抗原吸附板上,但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙;
封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。
下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。
(1)包被ELISA板:
1) 试剂和器材(老师已经在ELISA板上统一标记好)
a. ;
b. 绵羊红细胞抗原-SRBC;(a和b为包被液,实验室老师已经配好)
c. 聚乙烯塑料板,微量加样器
2) 操作方法
a. 包被液:碳酸盐缓冲液1:200 稀释抗原SRBC; b. 聚乙烯塑料板:8孔/2人,每孔加100ul包被液,37度恒温2小时。
(2) 微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下,老师教学生看量程):
1) 量取样品时选择适当量程的加样器,(P20: ~ μl;P200: 20~200 μl; P1000:200~1000 μl)。老师结合不同型号的微量加样器,指导如何读数,白色由左至右读数,黑/蓝色由上至下读数。
2) 转动旋钮,调整量取体积。顺时针旋转增加体积,逆时针减少体积。禁止超出量程范围,否则会损坏加样器。若有损坏需赔偿。
3) 拇指操作加样器芯,其它四指弯曲握住加样器。
4) 让学生了解不同量程的枪头(白色P20,黄色P200,蓝色P1000),如果是无菌要求的实验还得注意无菌操作。
5) 向下按加样器芯时会遇到两个阻力点。到达第一个阻力点时为量取液体的体积。继续按会遇到第二个阻力点,只在
完全排出液体时使用。吸取液体时只需按到第一个阻力点。
6) 吸取液体时将加样器芯按到第一阻力点,将枪头尖垂直浸入液面约
2~3mm,注意枪头不全部浸入液面,以免枪体接触液面腐蚀枪体。注意不要让枪头口碰到容器底。缓慢松开加样器芯,不能过快,否则倒吸入加样器内。吸入液体后不能将微量加样器倒置。
7) 吸取不同样品时必须更换枪头,加入液体时枪头要沿孔壁缓慢将液体注入实验孔中。
2. 学生操作(8:15-8:25,10分钟);注意:8:30前必须完成包被。学生操作包被反应板,空白处标记,统一以学号做标记,收集一起,温箱2小时(8:25-10:25)。
8孔/2人,每孔加100ul包被液,37度恒温2小时。如果时间紧张,包被后温箱孵育可以缩减到1小时40分
二、眼球取血和