实验十一 注射用胰蛋白酶效价测定.doc

文档介绍：实验十一注射用胰蛋白酶效价测定
实验十一注射用胰蛋白酶效价测定
一、实验目的
1掌握胰蛋白酶活力的测定方法-酶速率测定法。
2掌握紫外分光光度计的原理和使用方法。
二、实验原理
N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯为底物,用紫外吸收法进行测定的原理是:N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L-精氨酸。在胰蛋白酶的催化下,随着酯键的水解,苯甲酰L-精氨酸逐渐增多,反应体系的紫外吸收随之相应增加。%-%;若按干燥品计箅,则每1mg中胰蛋白酶的活力不得少于2500单位。
酶活单位定义:在底物BAEE浓度1mmol/L,光程1 cm,波长253nm,温度25℃,测量体积3ml,.(A/min=)为1个BAEE酶活单位。
三、试剂与器材

胰蛋白酶注射剂:规格(1)1. 2 5万单位(2)2. 5万单位(3)5万单位(4)10万单位 N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯盐酸盐

(1):取12mol/
蒸馏水混合。
(2)0. 067mol/L磷酸二氢钾溶液:。
(3)0. 067mol/L磷酸氢二钠溶液:。
(4)磷酸盐缓冲液:0. 067 m o l / L磷酸二氢钾溶液13mL与0. 067mol/L磷酸氢二钠溶液87ml混合,pH值为7. 6。

试管及试管架、移液管、100ml容量瓶、紫外分光光度计等。
四、实验步骤

取N - 苯甲酰- L - ,加水溶解使成100m l,作为底物原液;取10ml,用磷酸盐缓冲液稀释成100ml , 用紫外- 可见分光光度法( 附录IVA ) , 恒温于25. 0°C ± 0 . 5°C ,以水作空白,在253nm的波长处测定吸光度,必要时可用上述底物原
液或磷酸盐缓冲液调节,使吸光度在0. 575-0. 585之间,作为底物溶液。制成后应在2小时内使用。

取本品5支,分别加适量0 .001mol/L盐酸溶液溶解,并全量转移至同一 100ml容量瓶中,用上述溶液稀释至刻度,摇匀。精密量取适量,用上述溶液定量稀释制成每lml中约含50-60单位的溶液。

,,作为空白。另取供试品溶液200μl,加底物溶液(恒温于25. 0