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及其扩增产物的鉴定分析
综合性设计性实验
此实验验共包包括如如下六六个部部分
第一部部分,,目的的基因因选择择
第二部部分,,PCR引引物设设计
第三部部分,,PCR实实验操操作
第四部部分,,PCR产产物电电泳鉴鉴定
第五部部分,,PCR产产物测测序鉴鉴定
第六部部分,,目的的基因因序列列变异异分析析
第一部部分目目的基基因选选择
候选基基因简简介
在本实实验中中,有有三个个候选选基因因,分分别是是NGAL,,Fascin和Ezrin。
这三个个基因因在食食管癌癌及其其他多多种肿肿瘤中中呈过过表达达,说说明它它们在在肿瘤瘤的发发生发发展中中起重重要的的生物物学作作用。。
汕头大大学医医学院院生物物化学学与分分子生生物学学教研研室李李恩民民课题题组曾曾对这这三个个基因因进行行了深深入研研究,,在国国外杂杂志上上发表表SCI收收录研研究论论文20余余篇,,已形形成系系列优优势。。
同学们们可查查阅相相关资资料,,选择择感兴兴趣的的基因因来做做PCR实实验。。
NGAL((neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)即即中性性粒细细胞明明胶酶酶相关关脂质质运载载蛋白白,是是脂质质运载载蛋白白(lipocalin)家家族族的一一个成成员。。
NGAL基基因的的蛋白白产物物具有有保护护调节节基质质金属属蛋白白酶-9的的活性性,作作为小小分子子铁配配合物物结合合蛋白白参与与机体体铁代代谢和和天然然免疫疫反应应等功功能。。另外外,NGAL作作为一一种早早期标标志物物还可可以帮帮助判判定缺缺血性性肾损损伤程程度。。
NGAL基基因因
NGAL的的mRNA信息息在NCBI核核酸数数据库库中有有来自自不同同实验验室登登记的的多个个版本本,包包含完完整编编码区区的有有BC033089和NM_005564等,,编码码区长长为597bp,,编码码198个个氨基基酸,,包含含了N端前前部长长为20个个氨基基酸的的信号号肽序序列((为核核酸序序列的的1-60bp))
信号肽肽(signalpeptide):某某种分分泌蛋蛋白质质及细细胞膜膜蛋白白质等等,以以前体体物质质多肽肽的形形式合合成,,其N末端端含有有作为为通过过膜时时之信信号的的氨基基酸序序列,,这种种氨基基酸序序列称称信号号肽或或信号号序列列(signalsequence)。。
NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列:
前20个AA为信号肽序列
2001年年汕头头大学学医学学院生生物化化学与与分子子生物物学教教研室室李恩恩民课课题组组以永永生化化食管管上皮皮细胞胞系SHEE和和食食管癌癌细胞胞系SHEEC互互为对对照,,用cDNA微微列列阵进进行筛筛选,,用RNA印印迹和和RT-PCR进进行鉴鉴定,,cDNA克克隆测测序后后与GenBank进进行BLAST分分析比比较。。结果果表明明NGAL基基因在在SHEEC中中出现现显著著差异异过表表达,,其cDNA序序列列与小小鼠24p3、、大鼠鼠NRL(neu-relatedlipocalin)和和人人中性性粒细细胞NGAL具具有有较高高的相相似性性。这这提示示NGAL基基因在在永生生化食食管上上皮细细胞恶恶性转转化中中可能能发挥挥着重重要作作用,,可能能是一一种新新的癌癌基因因或促促癌基基因。。
A
B
利用cDNA芯芯片片筛选选两种种细胞胞的差差异表表达基基因
ABC
反转录录PCR检检测NGAL在在两种种细胞胞的mRNA水水平
Fascin蛋蛋白的的mRNA全长长为2767bp,,由5‘端端非翻翻译区区111bp碱碱基,,3’’端非非翻译译区1174bp碱碱基,,1482bp的全全编码码序列列区和和6个个PloyA信信号肽肽组成成,编编码493个氨氨基酸酸,分分子量量约为为55kD。
Fascin蛋白定位于于细胞质张力力纤维和细胞胞膜皱褶(ruffles),边缘缘的丝状伪足足(filopodia)、微棘(microspikes)的核心心肌动蛋白束束中。
Fascin基因
以往研究发现现,Fascin基因在在许多上皮来来源的肿瘤细细胞系,
如宫颈癌Hela、胃癌癌AGS、大大肠癌LM1215和SW480、、胰腺
癌BxPC3和T3H4等细胞系中中均上调表达达。
细胞的丝状伪伪足和微棘与与细胞的运动动,癌细胞的的转移有密
切关系,提示示Fascin蛋白可能能在细胞迁移移、细胞粘附附以及
细胞间信息交交流等过程中中发挥作用。。
ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAG
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Fascin基因的编码码区序列
Fascin基因的蛋白白序列