文档介绍：该【壳聚糖酶制备新工艺的制作方法】是由【开心果】上传分享，文档一共【7】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【壳聚糖酶制备新工艺的制作方法】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。壳聚糖酶制备新工艺的制作方法
专利名称:壳聚糖酶制备新工艺的制作方法
技术领域:
本发明涉及的是一种壳聚糖酶制备新工艺,属于生物工程技术领域。具体而言是指使用贵州绿僵菌(Metarhiziumguizhouense)固态发酵生产壳聚糖酶的新技术。
背景技术:
壳聚糖是几丁质的脱乙酰产物,是一种高分子阳离子絮凝剂。壳聚糖的降解产物壳寡糖具有较高的溶解性和生理活性,其低分子量壳寡聚糖(如五糖、六糖)还具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点,从而使其在食品,农业和医药领域有着广泛的应用前景。目前,由壳聚糖制备壳寡糖主要有两种方法化学降解法(如酸解法)和酶解法。利用专一性的壳聚糖酶水解壳聚糖,反应条件温和,可通过反应时间控制水解产物,壳寡糖产量高且质量稳定,是一种较为理想的大规模生产壳寡糖的制备方法。
壳聚糖酶主要存在于真菌和细菌细胞中,在单子叶和双子植物的不同组织中也发现有该酶活性。目前文献报道已经发现细菌(如Myxobacter,Bacillus),放线菌(如Steptomyces、Nocardioides),真菌(如Rhizopus,Aspperrgillus,Penicillum),病毒(ChlorellavirusPBCV-1、CVK-2)中有壳聚糖酶的存在,并已从发酵液中纯化得到壳聚糖酶。例如,《山东大学学报》
2003(1),96~99报道李风平等采用160r/min,25℃摇瓶培养腐皮镰孢菌产壳聚糖酶,;《食品与发酵工业》2004(2),57~61报道陈小娥等采用150r/min,30℃摇瓶发酵一株曲霉,粗酶液中壳聚糖酶活力为197mU/ml。综上所述,目前壳聚糖酶的发酵工艺具有两大特点。第一,壳聚糖酶产生菌产酶能力较低,酶活力不高,使得壳聚糖酶的来源有限,商品壳聚糖酶价格居高不下,难以大规模应用于工业化生产壳寡聚糖。第二,公开文献报道的壳聚糖酶制备工艺均采用液态发酵,液态发酵生产虽然适合工业自动化生产,但是其存在能耗大,需要大量淡水以及废弃物处理等问题;而且对于最后产酶来说,目前液态发酵产酶的浓度较低,给下游纯化带来了较大的压力。
发明内容
综合比较以上工艺路线,本发明提出了一种贵州绿僵菌固态发酵生产壳聚糖酶的新技术。该技术具有原料易得、生产成本低廉、操作简单、产酶能力稳定、壳聚糖酶活力较高、产品经济价值高、便于推广的优点,具有较高的经济和实用价值。
,购买于中科院微生物研究所。菌种于4℃保藏在PDA斜面培养基,即马铃薯培养基
(去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,加水1000mL,pH自然,煮沸后过滤)。半年转接一次。
。配方为(g/l)土豆汁20%,葡萄糖2%,%,MgSO4·%,%,。培养基灭菌后接种。于25~29℃培养7~10天,%Tween-80溶液洗下孢子,即得孢子种液。
,添加壳聚糖为壳聚糖酶诱导剂。培养基由固体营养基质和营养盐液组成。固体营养基质按重量计包括如下组分麸皮10~30份、黄豆粉30~80份、稻壳10~30份、~3份。营养盐液组成为(g/l),,,,。固态营养基质和营养液分别灭菌后,按重量比约为1∶1混合均匀,接种孢子液,在相对湿度为70%~85%的条件下,在25~29℃静态培养100~140h。
~8的缓冲液,机械搅拌1小时后,压滤除渣,所得上清液即为壳聚糖酶液。
。一个酶活力单位(U)定义为每分钟释放1μg盐酸氨基葡萄糖还原糖所需要的酶量。
本发明的上述方法使用的菌种是贵州绿僵菌,绿僵菌是一种广谱虫生真菌,利用其孢子可作为微生物杀虫剂,目前还没有利用其生产壳聚糖酶的文献报道。如德国拜耳公司在
20世纪80年代开发的金龟子绿僵菌()菌丝体颗粒剂BIO1020,用于防治葡萄黑耳喙象(OtiorrhynchussulcatusFabricius)。本发明采用固态发酵的方法,绿僵菌的产壳聚糖酶能力较高而且稳定,。
本发明的上述方法使用的是固态发酵。固态发酵在我国有着悠久的应用历史,具有耗能低,污染小,成本低廉,易于推广等优点。本发明充分利用固态发酵的优势,采用低廉的培养基成分,获得了壳聚糖酶的高产量。
下面通过若干实例的具体实施方式
,再对本发明的上述内容作进一步的详细说明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于下述的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式
实施例一(1)将保藏在PDA斜面的贵州绿僵菌菌种活化,在25℃培养9天,产生大量绿色分生孢子。%Tween-80溶液洗下孢子,玻璃棉过滤除去菌丝体后,转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中,120rpm振荡至孢子分散,即得孢子悬液。
(2)以组成为(g/l),,,
,,取10ml。取黄豆粉6g,麸皮2g,,稻壳2g混合均匀后作为固体营养基质。固态营养基质和营养液分别灭菌后,放入250ml三角瓶中混合均匀,接入孢子悬液。在相对湿度为75%的条件下,在26℃静态培养100h。
(3)向培养物加入100ml20mmol/L醋酸缓冲液(),机械搅拌1小时后,纱布压滤除渣,。
实施例二(1)将保藏在PDA斜面的贵州绿僵菌菌种活化,在28℃培养8天,产生大量绿色分生孢子。%Tween-80溶液洗下孢子,玻璃棉过滤除去菌丝体后,转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中,120rpm振荡至孢子分散,即得孢子悬液。
(2)以组成为(g/l),,,,,取15ml。取黄豆粉9g,麸皮3g,,稻壳3g混合均匀后作为固体营养基质。固态营养基质和营养液分别灭菌后,放入250ml三角瓶中混合均匀,接入孢子悬液。在相对湿度为80%的条件下,在27℃静态培养120h。
(3)向培养物加入20mmol/L醋酸缓冲液()150ml,机械搅拌1小时后,纱布压滤除渣,。
实施例三(4)将保藏在PDA斜面的贵州绿僵菌菌种活化,在27℃培养10天,产生大量绿色分生孢子。%Tween-80溶液洗下孢子,玻璃棉过滤除去菌丝体后,转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中,120rpm振荡至孢子分散,即得孢子悬液。
(5)以组成为(g/l),,,,,取20ml。取黄豆粉12g,麸皮4g,,稻壳4g混合均匀后作为固体营养基质。固态营养基质和营养液分别灭菌后,放入250ml三角瓶中混合均匀,接入孢子悬液。在相对湿度为80%的条件下,在28℃静态培养130h。
(6)向培养物加入20mmol/L醋酸缓冲液()200ml,机械搅拌1小时后,纱布压滤除渣,。
权利要求
,用贵州绿僵菌(Metarhiziumguizhouense)固态发酵生产壳聚糖酶,其特征在于将保藏在PDA斜面(马铃薯培养基)的贵州绿僵菌菌种活化,产生大量绿色分生孢子,然后洗下孢子,制得孢子悬液,接种孢子悬液进行固态发酵。发酵结束后向培养物加入缓冲液提取壳聚糖酶。
,其特征在于使用的菌种是贵州绿僵菌。
,其特征在于使用的发酵工艺是固态发酵。
,其特征在于固态发酵使用的培养基由固体营养基质(按重量计麸皮10~30份、黄豆粉30~80份、稻壳10~30份、~3份)和营养盐液(,,,,)组成。固态营养基质和营养液按重量比约1∶1混合均匀。
,其特征在于固态发酵使用的条件是相对湿度为70%~85%,25~29℃静态培养100~140h。
全文摘要
本发明涉及壳聚糖酶的制备新工艺,将保藏在PDA斜面(马铃薯培养基)的贵州绿僵菌菌种活化,产生大量绿色分生孢子,然后洗下孢子,制得孢子悬液,接种孢子悬液进行固态发酵。发酵结束后向培养物加入缓冲液提取壳聚糖酶。该工艺具有原料易得、生产成本低廉、操作简单、产酶能力稳定、壳聚糖酶活力较高、产品经济价值高、便于推广的优点,具有较高的经济和实用价值。