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专利名称:合成cDNA的方法
技术领域:
本发明涉及一个合成cDNA的新方法和用于所述方法的试剂盒,它们对基因工程是非常有用。
背景技术:
分析来自各种基因的mRNA分子对于阐明生物现象是非常重要的。来自逆转录病毒的一种RNA依赖性DNA聚合酶-所谓的逆转录酶的发现,已经使得利用RNA作为模板合成cDNA的逆转录反应成为现实。结果,分析mRNA分子的方法加快了它的进程。而且,现在利用逆转录酶分析mRNA分子的方法已经成为研究基因必不可少的实验方法。另外,这些已经应用于克隆技术和PCR技术的方法已经成为必不可少的技术,不仅应用于研究基因而且应用于各种各样的领域包括生物学、药学和农业。
然而,常规的逆转录方法存在许多问题,例如cDNA合成反应中断、无法合成长链cDNA、低保真度以及由于反应需要长时间而在反应的过程中损害RNA模板。
认为cDNA合成反应中断是由于作为模板的RNA形成二级结构所致。对于来自逆转录病毒的逆转录酶的最佳反应温度要低。在该温度下的反应中RNA形成复杂的二级结构。于是,cDNA合成反应在这种二级结构的位点中断。已经提出了一种利用耐热逆转录酶的方法来解决上面提到的问题。然而,这个方法的反应性并不是令人满意的。另外,尚不知道逆转录酶在逆转录反应中显现出校正活性,也不知道高保真性地合成
cDNA的方法。
如上面所描述的,依照常规的方法难以高效、高保真度地合成cDNA。因此,需要一种更有效的合成cDNA的方法。
发明目的考虑了上面所描述的现有技术作出本发明。本发明的主要目的是解决与现有技术相关的问题以及提供一种具有高反应效率和准确性的合成cDNA的方法。
发明概述在下面概要说明了本发明。本发明的第一个方面涉及合成cDNA的方法,其特征在于,该方法包括在存在一种具有逆转录活性的酶和另外一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的情况下进行逆转录反应。
本发明的第二个方面涉及扩增cDNA的方法,其特征在于该方法包括利用依照第一方面的方法合成的cDNA作为模板进行基因扩增反应。
本发明的第三个方面涉及用于合成cDNA的试剂盒,它包含一种具有逆转录活性的酶和另外一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶。
本发明的第四个方面涉及利用依照本方法第一方面合成的cDNA作为模板进行基因扩增反应来扩增cDNA的试剂盒,它包含一种具有逆转录活性的酶和另外一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶以及一种用于基因扩增反应的试剂。
本发明人已经发现,在cDNA合成反应中存在具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的情况下,通过进行逆转录反应提高了cDNA合成的效率和保真度。因此,完成了本发明。发明详述本发明的合成cDNA方法的一个主要特征是,在包含一种具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的逆转录反应系统中,利用RNA作为模板合成cDNA。
含有可以用于本发明方法的RNA的样品的实例包括但不限于来自生物的样品例如一个细胞、一个组织和血液以及可能包括有机体的样品例如食物、土壤和污水。样品可以是依照已知方法处理上面提到的样品而获得的含有核酸的制备物。可以用于本发明的制备物实例包括细胞破坏的产物,或是通过分离所述产物而获得的样品、所述样品中的总RNA、或是含有丰富的特殊RNA分子例如mRNA的样品。
能够应用于本发明方法的RNA包括但不限于样品中的RNA分子(例如总RNA、mRNA、tRNA和rRNA)以及特殊RNA分子(例如每一个都有共同碱基序列基元的RNA分子、利用RNA聚合酶获得的转录物和通过扣除方法浓缩的RNA分子)。任何能够制备用于逆转录反应的引物的RNA都可以应用。
在本发明中用于从模板RNA合成cDNA的引物并不是局限于特定的引物,只要它是其核苷酸序列互补于模板RNA的核苷酸序列并且可以在所用的反应条件下退火至模板RNA的寡核苷酸就可以。引物可以是寡核苷酸,例如
Oligo(dT)或具有随机序列的寡核苷酸(随机引物)。
考虑到特异性退火,引物的长度优选为6个核苷酸或更多,更优选为10个核苷酸或更多。考虑到寡核苷酸的合成,引物的长度优选为100个核苷酸或更少,更优选为30个核苷酸或更少。例如,依照亚磷酰***方法,利用AppliedBiosystemsInc.(ABI)的394型DNA合成仪可以合成寡核苷酸。或者,包括磷酸三脂方法、H-膦酸脂方法和硫代膦酸脂方法在内的任何方法都可以用于合成寡核苷酸。寡核苷酸可以从生物样品中获得。例如,从用限制性内切核酸酶消化的天然样品制备的DNA中可以分离和制备寡核苷酸。考虑到从模板RNA合成cDNA,,。考虑到对反应的抑制作用,引物的浓度优选为10μM或更小,更优选为5μM或更小。
任何具有逆转录活性的酶都可以应用于本发明,只要它们具有利用RNA作为模板合成cDNA的活性。然而,在高温下具有逆转录活性的酶(即抗热逆转录酶)对于本发明的目的是优选的。可以应用的这类酶的实例包括来自栖热菌属(Thermus)细菌的DNA聚合酶(例如,TthDNA聚合酶)和来自芽孢杆菌属(Bacillus)嗜热菌的DNA聚合酶。在反应混合物中存在锰离子对于TthDNA聚合酶逆转录活性的发挥是必不可少的。已知锰离子降低
PCR中的保真度。因此,当使用TthDNA聚合酶的逆转录反应混合物应用于PCR时,需要清除锰离子。来自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶并不需要为了发挥它的逆转录活性而加入锰离子,以及在PCR中去除锰离子。关于这一点,来自芽孢杆菌属嗜热菌的DNA聚合酶对于本发明是优选的。来自坚热芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)的DNA聚合酶(在下文被称为BcaDNA聚合酶)和来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的DNA聚合酶(在下文被称为BstDNA聚合酶)是优选的。这些酶对于所述反应来说并不需要锰离子。此外,当在高温条件下抑制模板RNA二级结构的形成时,它们可以应用于合成cDNA。
坚热芽孢杆菌是一种嗜热菌,它的最适生长温度大约是70℃。已知来自这种细菌的BcaDNA聚合酶具有DNA依赖性DNA聚合酶活性、RNA依赖性DNA聚合酶活性(逆转录活性)、5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切核酸酶活性。
这种酶可以是从它的最初来源纯化而来的酶,或者是利用基因工程技术制造的重组蛋白。可以通过基因工程技术或其他方法对这种酶进行修饰,例如置换、缺失、添加或插入。这些修饰后的酶的实例包括BcaBESTDNA聚合酶(TakaraShuzo),这是一种缺乏它的5’-3’外切核酸酶活性的BcaDNA聚合酶,以及大片段的BstDNA聚合酶(NeWEnglandBiolabs),这是一种缺乏它的5’-3’外切核酸酶活性的BstDNA
聚合酶。以上提到的这些缺乏它们的5’-3’外切核酸酶活性的酶可以特别优选用于本发明中。
具有逆转录活性的酶的使用量没有特别的限定。例如,该酶可以按常规逆转录反应的用量使用。为了使得cDNA合成反应更加有效地进行以及缩短反应时间,与常规方法用量相比,可以增加具有逆转录活性的酶的用量。例如,当利用BcaBESTDNA聚合酶以20μl的反应体积进行逆转录反应时,。考虑到cDNA合成反应的效率,优选为22U或更多,更优选为42U或更多。此中所描述的DNA聚合酶的活性是建立在对商品化酶的指标基础上的。在适合于DNA聚合酶的反应条件下,在30分钟内将10nmol总核苷酸掺入到酸不溶性沉淀中,的酶活性定义为1U。使用适合于每一种DNA聚合酶的模板DNA和反应温度。例如就BcaBESTDNA聚合酶而言,利用多聚脱氧(ATP-TTP)作为模板/引物,在60℃下在30分钟内将10nmol总核苷酸掺入到酸不溶性沉淀中的酶活性定义为1U。
本发明的合成cDNA的方法的特征在于,它包括在存在具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的情况下,进行逆转录反应。在本发明中使用的具有3’-5’外切核酸酶活性的酶并不是限制于特定酶,只要它具有这种活性。例如,可以利用具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。这些酶的实例包括α型DNA聚合酶,例如来自热球菌属(Pyrococcus)细菌的DNA
聚合酶(PfuDNA聚合酶(Stratagene)、PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuzo)、DeepVentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)、KODDNA聚合酶(Toyobo)、PwoDNA聚合酶(Boehringer)等),和来自热球菌属(Thermococcus)细菌的DNA聚合酶(VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)等);以及polI型DNA聚合酶,例如来自大肠杆菌的DNA聚合酶(聚合酶I的Klenow片断等)和来自噬菌体的DNA聚合酶(T4DNA聚合酶等)。优选地是利用显示出强烈的3’-5’外切核酸酶活性的α型DNA聚合酶。polI型DNA聚合酶或α型DNA聚合酶是指依照氨基酸序列同源性分类的一系列酶。所述氨基酸序列的特性在NucleicAcidsResearch,154045-4657(1991年)中有描述。
对于本发明的目的,要使用作用于与RNA杂交的DNA的3’末端的酶。另外,优选为在高温下显现出3’-5’外切核酸酶活性的酶。在这一方面,优选为来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶。以来自热球菌属(Pyrococcus)细菌的DNA聚合酶作为来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶的例子。
利用依照上面所描述的方法获得的cDNA作为模板进行核酸扩增反应,可以扩增cDNA。然而,它并不是要限制本发明,例如,聚合酶链式反应就用作核酸扩增反应。用于PCR的酶并不限制于特定的某一种酶。可以利用常规用于PCR的DNA聚合酶。依照上面所描述的方法获得的cDNA是由模板RNA
高保真合成而来的。需要高保真性地进行PCR以便尽可能准确地从所述RNA复制所述序列。因此,例如来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶的具有高保真度的DNA聚合酶优选用于本发明的cDNA扩增。当具有3’-5’外切核酸酶活性的抗热DNA聚合酶(例如来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶)用于cDNA合成步骤时,在所述PCR步骤中也可以利用同样的酶。cDNA合成/(,NucleicAcidsReasearch,243546-3551(1996年))来确定。
这种酶可以是从它的最初来源纯化而来的酶,或者是利用基因工程技术制造的重组蛋白。可以通过基因工程技术或其他方法对这种酶进行修饰,例如置换、缺失、添加或插入。具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶显现出校对活性,即使用RNA为模板,所述核对活性也可以有效的消除错误掺入到合成的cDNA中的碱基。因此,它可以用于高保真度地合成cDNA。考虑到cDNA合成的效率,20μl反应体积中的酶用量优选为1U或更少,。考虑到校对活性,,。
与传统的逆转录方法相比,通过利用本发明的方法,可以增加合成的cDNA的数量、可以合成更长的cDNA以及高保真度地合成cDNA。此外,与传统的方法相比,通过把本发明的方法与相关技术例如克隆技术和
PCR技术结合起来,有可能制备cDNA文库或更有效地进行RT-PCR,因而允许更准确地分析由于低表达水平很难利用传统方法进行分析的mRNA。
本发明的合成cDNA的试剂盒是用于上面所描述的合成cDNA的方法的试剂盒。它是一种具有高保真度和高效性合成cDNA的试剂盒。包含具有逆转录活性的酶和前面所述的具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的试剂盒可以作为这种试剂盒的实例。该试剂盒可以包括用于利用前面所述的酶进行cDNA合成反应的反应缓冲液、核苷酸和其他试剂。利用这样一种试剂盒可以有效地、高保真度地以及容易地合成cDNA。
本发明的扩增cDNA的试剂盒是用于上面所描述的扩增cDNA的方法的试剂盒。它是种个具有高保真度和高效性扩增cDNA的试剂盒。包含具有逆转录活性的酶和前面所述的具有3’-5’外切核酸酶活性的酶以及用于进行基因扩增反应的试剂的试剂盒可以作为这种试剂盒的实例。当利用cDNA作为模板,把PCR用作基因扩增反应时,所述用于扩增反应的试剂包括抗热DNA聚合酶、反应缓冲液、核苷酸和其他试剂。利用这样一种试剂盒可以有效地、高保真度地以及容易地扩增cDNA。当具有3’-5’外切核酸酶活性的抗热DNA聚合酶(即来源于高噬热古细菌的α型DNA聚合酶)用于cDNA合成步骤时,在所述PCR步骤中也可以利用同样的酶作为前面所述的扩增反应的DNA聚合酶。
在下面的实施例中,各自酶的活性是依照酶所附的说明指示来表达。实施例1制备RNA除非另外说明,否则在下面的实施例中用到的RNA是利用TRIzol试剂(LifeTechnologies)并依照试剂所附的说明从培养的人U-937细胞(ATCCCRL-1593)中制备的。。RNA的纯度为OD260/OD280=。实施例2BcaBESTDNA聚合酶和PvrobestDNA聚合酶的联合作用在cDNA合成中加入具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的作用,可以利用来源于坚热芽孢杆菌并缺乏它的5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶(BcaBESTDNA聚合酶,TakaraShuzo)作为逆转录酶和来源于热球菌(Pyrococcussp.)的DNA聚合酶(PyrobestDNA聚合酶,TakaraShuzo)作为3’-5’外切核酸酶来检测。
利用BcaBESTRNAPCR试剂盒()(TakaraShuzo)进行cDNA合成反应。依照试剂盒所附指南制备含有下面所述的酶和Oligo(dT)的20μl体积的反应混合物。将反应混合物放入PCR热循环仪PERSONAL(TakaraShuzo)中,在60℃进行逆转录反应1分钟、2分钟、3分钟或4分钟。预定时间的反应完成后,在98℃加热反应物5分钟。
酶1BcaBESTDNA聚合酶22U/反应系统酶2BcaBESTDNA聚合酶42U/反应系统酶3BcaBESTDNA聚合酶22U++