发酵乳的制造方法 1.docx

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专利名称:发酵乳的制造方法
技术领域:
本发明涉及通过使具有细胞壁局部存在性蛋白酶(cellwall-envelopedproteinase,PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、和双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌
共发酵而得到的发酵乳的制造方法。本申请要求2008年6月11日在日本申请的日本特愿2008-152949号的优先权,并将其内容援引于此。
背景技术:
已知双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌、即双歧杆菌是在人的肠道内形成的肠道
菌群的优势菌种之一,具有恢复肠内细菌平衡的整肠作用、免疫增强作用、抗肿瘤作用寸。因此,近年来,随着消费者的健康意识的提高,对双歧杆菌发酵乳等含有活双歧杆菌的食品的需求正在增加。双歧杆菌在乳类培养基中的增殖性差。因此,为了使发酵乳中含有一定量的、例如IXIO7CFUAnL的双歧杆菌,通常需要添加酵母提取物等各种增殖促进物质。但是,前述增殖促进物质通常价格昂贵,还可能有损风味。公开了通过使其与除双歧杆菌以外的乳酸菌的混合发酵来改善双歧杆菌的生长性、保存存活性而不必添加前述生长促进物质等的各种方法。关于改善制造发酵乳时的双歧杆菌的生长性的方法,例如公开了
(1)一种酸奶及其制造方法,其特征在于,含有乳酸乳球菌乳酸亚种()、乳酸乳球菌乳脂亚种()及双歧杆菌属(例如参照专利文献1。)。此外,关于改善发酵乳的双歧杆菌的保存存活性的方法,例如公开了(2)—种双歧杆菌发酵乳的制造方法,其特征在于,在以乳作为主要成分的培养基中,混合培养短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、以及不生成丁二***及乙偶姻的乳酸乳球菌乳酸亚种(例如参照专利文献2。)。专利文献1日本专利第3364491号公报专利文献2日本专利第3068484号公报
发明内容
发明要解决的问题然而,在上述(1)的方法中,未必可以说具有充分的促进双歧杆菌的生长及缩短发酵时间的效果。另外,在存在乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种这2种菌的条件下可促进双歧杆菌的生长,但关于分别单独使用乳酸乳球菌乳酸亚种或乳酸乳球菌乳脂亚种时的效果,完全没有记载。
另一方面,在上述(2)的方法中,通过使用由特定的双歧杆菌和特定的乳酸菌组成的混合菌,确认到增殖促进效果和存活性改善效果这两方面,但关于除短双歧杆菌以外的双歧杆菌、例如食品中通用的长双歧杆菌,完全没有记载。本发明的目的在于提供一种发酵乳的制造方法、及通过前述制造方法制造得到
的发酵乳,其使用了能够改善双歧杆菌的增殖性的乳酸菌。用于解决问题的方案本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究,结果发现,使具有细胞壁局部存在性蛋白酶PrtP的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)与双歧杆菌混合发酵时,能够促进双歧杆菌的增殖,从而完成了本发明。S卩,本发明提供一种发酵乳的制造方法,其特征在于,使用具有细胞壁局部存在性蛋白酶(cellwall-envelopedproteinase,PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、和双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌使发酵底物(fermentationbase)发酵。另外,本发明提供一种发酵乳的制造方法,在前述方法中,前述双歧杆菌属菌为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。另外,本发明提供一种发酵乳的制造方法,在前述方法中,前述长双歧杆菌为长双歧杆菌ATCCBAA-999菌株和/或长双歧杆菌模式菌株(typestrain)ATCC15700菌株。另外,本发明提供通过前述任一项记载的发酵乳的制造方法制造得到的发酵乳。发明的效果根据本发明的发酵乳的制造方法,能够有效地制造含有前所未有的大量双歧杆菌、特别是长双歧杆菌的发酵乳。另外,通过本发明的发酵乳的制造方法制造得到的发酵乳,其整肠效果更好,在健康管理上也有用。
图1是表示将PCR产物通过电泳法进行分离并通过染色进行检测而得到的区带
图案的图,所述PCR产物是以来源于乳酸乳球菌各菌株的DNA作为模板、并使用检测PrtP酶基因的引物进行PCR而得到的。
具体实施例方式本发明中所用的乳酸菌是具有PrtP酶的乳酸乳球菌。PrtP酶是存在于细胞膜且活性部位露出细胞表面的酶。作为具有PrtP酶的乳酸菌,报道了例如乳酸乳球菌乳脂亚禾中()、乳酸乳球菌乳酸亚禾中()等乳球菌属菌中若干具有PrtP的菌株。迄今为止,来源于乳酸乳球菌的PrtP酶中,已知的有巧型(几乎不分解α-酪蛋白,且从C末端的附近很好地分解β-酪蛋白)、P111型(从C末端及N末端这两个方向很好地分解α-酪蛋白及β-酪蛋白)及其中间型(P/Pm型)(例如参照Reid,,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1"4年、第6O卷第3号、第8Ol洲6页。)。具体而言,作为来源于乳酸乳球菌的PrtP酶,可列举出NCBI(NationalcenterforBiotechnologyInformation)中基因序列登录号为AY542690、AY542691等的PrtP酶等。某种乳酸菌是否是具有PrtP酶的乳酸菌,可如下进行确认例如利用PCR(PolymeraseChainReaction)等基因分析技术,调查是否具有编码PrtP酶的PrtP基
因。
由于PrtP酶在细胞外具有酶活性部位,因此能够分解培养基中的蛋白质。例如乳酸菌在乳类培养基中增殖时,PrtP酶分解乳类培养基中的乳蛋白质,提供乳酸菌的生长所需要的寡肽、氨基酸。因此,具有PrtP酶的乳酸乳球菌具有增殖快、发酵性强的特征,在10%(W/W)还原脱脂奶粉培养基中在2530°C的温度范围内培养16小时时,即能够使培养基凝固。利用这种增殖性、发酵性高的特征,能够检测具有PrtP酶的乳酸乳球菌。此外,通过检测PrtP酶活性,也能够检测具有PrtP酶的乳酸乳球菌。本发明中使用的乳酸乳球菌只要具有PrtP酶,则没有特别限定,优选为乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种等。这是由于,在发酵乳等以双歧杆菌作为原料的乳制品中,它们一直以来作为原料而被使用,因此认为安全性高。作为具有PrtP酶的乳酸乳球菌,例如有乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株等。以下,对本发明中使用的具有PrtP酶的乳酸乳球菌及双歧杆菌增殖促进作用进行更详细的说明。(ATCC19257t)菌株、乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007(NCD0497)菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株、及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株是否具有PrtP酶进行确认。具体而言,%乳糖及葡萄糖的
Difco(注册商标)M17Broth(Becton,Dickinson公司制造)中接种各菌株3%,在30°C下培养16小时。通过离心分离得到菌体,使用DNeasy血液和组织试剂盒(DNeasyBloodandTissuekit)(QIAGEN公司制造)提取DNA,通过PCR法确认是否存在PrtP基因。PCR根据参考文献(JournalofAppieidMicrobiology、2006年、第100卷、第13071317页。)中记载的方法进行。引物使用正向引物GBf(GCAAATACGGTGACGGCTGCGA)及反向引物GB2r(TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC)的弓I物对、或正向引物GHf(CAAATACGGTGACGGCTGCTAA)及反向引物GH2r(TAGCATTATAATAGGTCTTCGTCA)的弓|物对。图1是表示通过电泳法分离PCR产物并通过染色检测到的区带图案的图。图1中,“1”是分子量标准(molecularweightmarker)跑出来的条带,“2”是乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌株的PCR产物跑出来的条带,“3”是乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株的PCR产物跑出来的条带,“4”是乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007菌株的PCR产物跑出来的条带,“5”是乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株的PCR产物跑出来的条带,“6”是乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株的PCR产物跑出来的条带。该结果确认乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株中存在PrtP基因。另一方面,确认乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625
菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株各菌株中不存在PrtP基因。
,%乳糖及葡萄糖的Difco(注册商标)M17Broth(Becton,
Dickinson公司制造)中接种各菌株3%,在30°C下培养16小时。通过离心分离收集菌体,洗涤后,悬浮于与原先的培养液等量的下述组成的乳类培养基中,得到种子培养物(seedculture)。接着,将含有(W/W)葡萄糖、10%(W/W)还原脱脂奶粉的乳类培养基在95°C下杀菌30分钟,接种前述各菌株的种子培养物3%,在30°C下培养16小时。将所得培养液骤冷,测定凝固状况、pH及所含的乳酸菌数。乳酸菌数的测定通过市售的加有BCP的平板计数琼脂培养基(荣研器材公司制造)平板来进行。测定结果示于表1中。具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株中,,培养基凝固。另外,所含的乳酸菌数也为3X108CFU/g以上,获知增殖性和发酵性非常良好。相对地,不具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007菌株、及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株的各菌株中,,培养基没有凝固,乳酸菌数为IXlO8CFlVg以下。[表1]
权利要求
,其特征在于,使用具有细胞壁局部存在性蛋白酶(cellwal卜envelopedproteinase,PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、禾口双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌使发酵底物发酵。
,所述双歧杆菌属菌为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。
,所述长双歧杆菌为长双歧杆菌ATCCBAA-999菌株和/或长双歧杆菌模式菌株ATCC15700菌株。
。
全文摘要
提供一种发酵乳的制造方法、及通过所述制造方法制造得到的发酵乳,其使用了能够改善双歧杆菌的增殖性的乳酸菌。一种发酵乳的制造方法、及通过所述发酵乳的制造方法制造得到的发酵乳,其特征在于,使用具有细胞壁局部存在性蛋白酶(cellwall-envelopedproteinase,PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、和双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌使发酵底物发酵。