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专利名称:发光干细胞及其应用的制作方法
发光千细胞及其应用
本发明涉及用编码脱辅基发光蛋白(apophotoprotein)的基因稳定转染的重组干细胞。更具体地,本发明涉及非人全能性千细胞,涉及多能性胚胎干细胞,涉及人和非人多能性肿瘤细胞,多能性成年干细胞和其祖细胞。重组发光蛋白干细胞系被用于不同的目的,例如在高通量筛选中,
和以分化状态用于对内源表达的耙基因进行筛选背景技术:
干细胞是未特化的细胞,其能通过细胞分裂长时间地更新自身(1)。此外,在某些生理或实验条件下,它们可以分化成不同的细胞类型,例如搏动心肌细胞或胰腺的胰岛素生产细胞(2,3)。
基于它们的潜能,可以将干细胞细分和分类。全能性干细胞由卵细胞和精细胞的融合产生。通过受精卵细胞的前几次分裂生成的细胞也是全能的。这些细胞可以生长成任意类型的细胞。多能性干细胞是全能性细胞的后代,且可以分化成除全能性干细胞以外的任意细胞类型。多能性干细胞仅可以生成密切相关的细胞家族的细胞(例如血细胞例如红血细胞,白血细胞和血小板)。祖(有时称作偏能性)细胞仅可以生成一种细胞类型,但是具有可以将它们与非干细胞区分开的自更新特性(3-6)。
根据它们的来源,也可以将干细胞分类成成年的或胚胎的。成年干细胞是在特定组织的分化细胞中发现的未分化的细胞,大多数是多能性的,能生成几种、但是有限数目的细胞类型。它们也包含新生儿的、脐带的、胎盘的和羊水衍生的干细胞。它们也称作体干细胞或组织干细胞,存在于分化组织中,它们在所述分化组织中以受控的方式分化和/或分裂,以生成它们的来源组织的所有特化细胞类型(7-9)。
胚胎干细胞具有变成所有类型的特化细胞、包括精细胞的潜力(多能
性)。在允许它们增殖但不分化的条件下,它们具有在培养中无限增殖的
能力(3)。迄今为止,已经从啮齿动物和人类发现了3种类型的多能性胚胎干细胞(10):
*胚胎干细胞(ES),它们源自预植入胚泡期胚胎的内细胞团。它们具有正常的核型。几种类型的小鼠和人胚胎干细胞是已知的和确定的,例如小鼠ESTBV2,Rl,D3细胞(11-13,63)。
*胚胎癌细胞(EC),它们源自畸胎癌。畸胎癌是含有多能性干细胞的性腺肿瘤,所述多能性干细胞存在于源自3种基本胚层(内胚层,中胚层和外胚层)的许多组织中。最常用的一种是小鼠ECP19细胞系。这些细胞不具有正常的核型(14-18)。
胚胎生殖细胞(EG),它们源自培养的胎儿生殖脊的原生殖细胞(PGC)。它们具有正常的核型,但是在遗传上被异常地印记(19-22)。
可以将ES和EG细胞注射进受体小鼠的胚泡,产生嵌合动物。在嵌合小鼠中,这些多能性细胞可以促成每种细胞类型,包括种系(20,21,23,24)。相反地,导入胚胎中的鼠EC细胞会寄居大多数胚胎谱系,但是通常不会寄居该种系,仅有一个实验例外(25-27)。EC细胞不能形成功能性配子,这最可能反映它们的异常核型(28)。干细胞是高通量筛选(HTS)技术的非常有力的工具,因为它们可以长期体外培养和繁殖,维持自更新特性,且它们可以经历小型化。它们允许使用可选择的和可诱导的标记来制备纯ES细胞群体。基因寻靶/同源重组技术允许敲除(KO)或敲入(KI)特定基因。此外,胚胎干细胞可以分化成类似原代细胞的任意细胞类型(因为它们是非肿瘤细胞)。以此方式,它们为靶物提供天然环境,它们可以寻址以天然方式调节和表达的复杂靶物(如多亚基离子通道)。这是一项非常重要的改进,因为通常在HTS筛选中,使用肿瘤细胞系建立基于细胞的测定,且已知该肿瘤环境可以改变细胞生理条件。
多能性胚胎干细胞的应用已经在药学领域取得基础作用(29)。例如用于靶物评价,因为在药物开发中理解基因功能是成功的基础,鼠ES细胞代表着一种比KO小鼠更快速且更廉价的工具。除了在致命性的
KO的情况下,ES细胞的应用对于基因功能评价是非常有帮助的。
干细胞还已经用于胚胎千细胞实验(EST),其^皮EVCAM(欧洲替代方法评价中心)研究积极评价。这是关于药物对从3种胚层镨系(内胚层,中胚层和外胚层)产生的细胞和组织分化的毒理学和畸形学的实验。干细胞对于分析对通过多能性干细胞的分化得到的搏动心肌细胞的变时性活性的药物继发效应,也是非常重要的。这类实验可以减少毒理学研究使用的动物的数量。例如在欧盟中,目前市场上的高达30000种化学试剂在将来的IO年中必须重新评价。这意味着使用约一千万动物。体外实验如EST的建立,在这个意义上是至关重要的,也可以允许在比常规全动物实验更少的时间内测试更多的化学试剂(30,31,32)。
生物发光是一种现象,它是由活的生物体发射可见光或通过多种化学发光反应系统由衍生自生物体的物质发射可见光。生物发光反应需要三种主要成分萤光素(底物)、萤光素酶(酶)和分子氧。然而,在某些反应中可能还需要一些其它成分,包括阳离子(Ca—和Mg++)和辅因子(ATP,NAD(P)H)。萤光素酶是催化底物萤光素发生氧化的一种酶,并产生不稳定的中间体。当不稳定的中间体衰减至基态时发光,同时产生氧化萤光素。虽然来自至少7个门的许多物种使用相同的萤光素,称之为腔肠素(coelenterazine),但还存在着许多不同、无关类型的萤光素。在有些
动物(例如水母)中,可以将萤光素/萤光素酶系统以稳定的"发光蛋白"的形式提取出来,它一旦与钙结合即可发光。发光蛋白与萤光素酶不同,因为它们是萤光素酶和萤光素的稳定氧化的中间体复合物。发光蛋白存在于许多海洋腔肠动物中,使它们能为了包括繁殖、喂养和防御在内的多种目的而发光(33)。虽然存在许多能发光的生物,但是迄今只分离到7种发光蛋白,即Thalassicolin(34,35)、水母发光蛋白(36,37,38)、Mitrocomin()(39,40)、Clytin()(40,41)、螅蛋白(34,38,42,43)、M腦iopsin(44,45)和Berovin(44,45)。所有这些蛋白质都是由脱辅基蛋白、咪唑并吡溱生色团(即腔肠素)和氧所形成的复合体。它们的氨基酸序列、尤其是包含三个4丐结合位点(EF手形结构)的区域是高度保守的。术语"发光蛋白"是指能够发光的腔肠素结合的多肽,而"脱辅基发光蛋白"指未与腔肠素
结合的发光蛋白。
研究最多的发光蛋白是从水母(Aequoreavictoria)(46)分离得到的水母发光蛋白和从长薮枝螅水母(Obelialongissima)(47)分离得到的螅蛋白。发光蛋白可以通过与腔肠素、分子氧、EDTA和2-巯基乙醇或二疏苏糖醇温育从脱辅基发光蛋白再生。由于腔肠素是由发光蛋白水母发光蛋白、
Mitrocomin、Clytin和螅蛋白^f吏用的共同发光底物,因而这四种发光蛋白的发光反应可能是相同的(48,49,50,51)。
细胞事件和它们的调节的研究需要灵敏的、非侵入性的分析方法。发光蛋白和通常使用的生物发光是优良的报告系统,因为它们与荧光系统不同,几乎没有背景。
发光蛋白广泛用于细胞培养系统中作为报告基因,以监视与信号转导和基因表达有关的细胞事件(33,34,46)。在哺乳动物细胞中表达发光蛋白,以监视应答不同刺激反应的钙变化。可以通过在表达脱辅基发光蛋白的哺乳动物细胞中加入辅因子腔肠素并检测光子的发射来测定细胞内的钙浓度,光子发射是胞内钙浓度的指示。使用同时表达与胞内钙浓度调控有关的脱辅基发光蛋白和受体的细胞,为筛选影响胞内钙释放的化合物提供了有效的系统。
利用发光蛋白作为报告系统还可以设计高通量的筛选测定方法。该系统的灵敏度和高信噪比4吏得能够使用小的测定体积。
一般以HTS形式进行钓流量测定,利用适于同时检测大量样品并且配备发光图像系统的光学筛选仪器进行检测。
然而,通过使用荧光钙染料如Fluo3,Fluo4,Fura2和钙染料(MolecularDevicesandMolecularProbes),同时寸吏用荧光测定仪如在HTS测定中最常用的仪器之一
FLIPR⑧(FluorometricImagingPlateReader,MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA,USA),也可以检测钓浓度变化。该仪器装备了一种光学检测装置,使之能在细胞单层上将信号分离,因此增强了基于细胞的测定的灵敏度。
最新的FLIPR⑧系统版本也已经适用于荧光测定,即使与基于CCD照相的装置相比灵敏度更低。为了克服该系统的更低的荧光灵敏度,具有增强的光发射的发光蛋白是非常有益的。
本发明的作者开发了基于借助于适当载体用发光蛋白编码序列稳定转染的干细胞的系统。转染的干细胞直接用于不同的筛选方法中。
发明内容
本发明的一个主题是,能在有合适的生色团底物存在下,响应于细胞内钩浓度变化而表达脱辅基发光蛋白且生成生物发光信号的稳定的重
组干细胞。干细胞意指全能性和/或多能性非人细胞;或人或非人多能性肿瘤细胞,或多能性细胞或其祖先,它们是胚胎、胎盘或羊水来源的,或是***来源的。具体而言,优选的干细胞是小鼠胚胎干细胞,优选ESTBV2(63)细胞和小鼠胚胎癌细胞系,P19(26-28,61)。P19细胞系可以具有一些优点,因为它可以在未分化状态进行培养,不需要LIF(
白血病抑制因子)和/或饲养细胞层。
脱辅基发光蛋白意指任意的脱辅基发光蛋白,可以是天然的或重组的或合成的。脱辅基发光蛋白可以是天然的或诱变的突变体,也具有提高的发光活性和/或钙灵敏度,和源自2种不同的天然脱辅基发光蛋白的嵌合蛋白,也通过删除、添加或置换一个或多个氨基酸残基而进一步修饰,条件是,维持或增加发光蛋白在光发射和钙响应性方面的活性。也可以针对哺乳动物密码子选择优化脱辅基发光蛋白序列,和/或融合至线粒体靶序列(52,53,54)。具有增强的生物发光的发光蛋白已经公开在现有技术中,即通过蛋白總蛋白与Clytin蛋白的一个区域的嵌合得到的发光蛋白Photina(记载在EP1413584,)。
具有增强的生物发光的发光蛋白也可以源自诱变,例如在下述位置Gly142—Cys诱变的Clytin序列(GenBank登记号Q08121);或在下述12个位置诱变的Clytin序列(GenBank登记号Q08121):Gly58—Glu,Asp69—Val,Ala。—Cys,Lys76—Arg,Lys77—Gly,Ile78—Cys,Asp81—Glu,Val86—lie,Glu87—Ala,Ala9。—Gln,Val92—Leu,和Glu97—Gln。
在遍在的、器官-、组织-、细胞-或发育阶段-特异性的或可诱导的启动子的控制下,可以克隆报告物脱辅基发光蛋白编码序列。
用本领域技术人员已知的标准转染方法,例如但不限于,电穿孔、
PEGCa"沉淀、阳离子脂质方法等,可以实现稳定重组。
有利地,稳定的重组干细胞可以分化成特定细胞语系,以表达至少
一种特定细胞谱系靶物,优选心肌细胞镨系,或者神经元傳系,或者间
充质细胞语系,或者内皮细胞i瞽系。
本发明有利地提供了鉴别和/或测试化合物的方法,所述化合物用于
许多用途,例如治疗、诊断用途。在本发明的上下文中,化合物文库是
有待测试或鉴别的化合物的集合,可以是合成的或重组的。
本发明的另一个主题是,鉴别能刺激干细胞向特定细胞谱系分化的
试剂的方法,其包含下述步骤
a)提供在未分化阶段的根据本发明的稳定的重组干细胞;
b)将所述细胞暴露于包含推定的分化诱导剂的化合物文库,以表达至少一种特定细胞谱系靶物;
c)给细胞装载合适的生色团作为底物;
d)用配体刺激所述特定细胞谱系靶物,从而得到细胞内Ca"的变化;