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专利名称:卵巢癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域:
本实用新型属生物技术领域,具体涉及一种卵巢癌遗传风险基因位点检测试剂盒,是通过利用荧光定量PCK,检测被检者基因组MA样本中的四个卵巢癌遗传风险基因SNP位点基因型的试剂盒。
背景技术:
卵巢癌是女性生殖系统常见的肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位,占所有妇科生殖系统恶性肿瘤的22.%左右。卵巢癌的发病率不是最高,但其病死率却居于各类妇科肿瘤的首位,
对妇女生命造成严重威胁。其根本原因在于卵巢的细胞发育、组织结构及内分泌功能较复杂,且卵巢癌
临床早期无症状,鉴别其组织类型及良、恶性相当困难,无论在诊断和治疗上都是难题。到目前为止,就
国内外临床资料统计,卵巢癌患者的五年生存率仅25%30%。
虽然卵巢癌的发病是一个复杂的过程,但遗传因素在其中的作用不可忽视。研究发现,I相代谢、叶酸代谢、肿瘤转移等相关基因是卵巢癌发病的重要因素,这些基因的变异将会影响卵巢癌的发病风险。通过基因检测可以确定遗传高风险人群,并可相应制定有针对性的预防和治疗策略,对降低卵巢癌的发病和
死亡都具有重要作用。
国内外大量的关联研究表明,卵巢癌的发病与I相代谢、叶酸代谢、肿瘤转移等相关基因上的SNP位点基因型有很密切的关系,其中最具临床意义的是细胞色素P4501B1基因(CYP1B1)上的Leu432Val位点、5,10-亚***四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的C677T位点、钙粘蛋白E基因(CDH1)上的C54T位点、基质金属蛋白酶7基因(MMP7)上的A-181G位点这四个SNP位点。
细胞色素P4501B1基因(CYP1B1)是细胞色素P450超基因家族成员,其表达的蛋白为肝外酶,主要在受内分泌调节的组织表达,如乳腺、卵巢、前列腺和子宫。CYP1B1被认为是多种癌症的候选易感基因,其功能是激活环境中的前致癌物,同时催化雌激素转变成为具有基因毒性的儿茶酚雌激素。研究表明,Leu432Val位点多态性导致CYP1B1基因编码的血红蛋白结合区(这一区域对CYPiBl的催化功能至关重要)的第3号外显子氨基酸的改变,迸而影响CYP1B1对多种前致癌物(如类固醇激素)的催化活性。野生型和具有多态性变异的CYP1B1对雌激素羟化作用存在明显差异。与Leu432相比,Val432的4-羟化活性明显升高4-羟化雎二醇与2-羟ftJH的比'值升高,增加了基因毒性效应,导致卵巢癌的发病风险上升。
5,10-亚***四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)的活性高低与卵巢癌的发病相关。当
MTHFR活性降低时,叶酸代谢通路受阻,并进一步阻碍DNA***化,容易引发包括卵巢癌在内的各种肿瘤。在这种情况下,通过增加叶酸的摄入量可以在一定程度上维持代谢途径中各种物质的浓度,供生命活动各种所需,可以降低由于MTHFR活性降低而引发的肿瘤易感风险的上升。MTHFR基因第5号外显子上的C677T位点突变,导致蛋白第222个氨基酸由Ala(A)变为Val(V)。该多态位点的基因型有CC、CT、TT,其中CT和TT被确定为卵巢癌的风险基因型。当携带风险基因型时,MraFR耐热性下降,酶活性减弱,生成5-***四氢叶酸减少,***传递通路受阻,引起DNA***水平降低,而低***化水平的DNA易引起DNA损伤和染色体畸变,最终导致卵巢癌等多种肿瘤的发病风险。
钙粘蛋白E基因与癌症恶性程度有关。当癌组织中钙粘蛋白E表达完全缺失或仅表达无粘附作用时,则癌细胞获得侵袭和转移能力。相比恶性程度高的癌细胞,恶性程度低的癌细胞中钙粘蛋白E表达较高。因此,基因功能的丧失被认为会通过增加增殖、侵入和/或转移引起癌症病情的恶化。多种恶性肿瘤中都发现钙粘蛋白E的表达量减少,如卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、皮肤癌、肾癌和肺癌等。CDH1基因上C54T位点是3'UTR端上的一个C/T多态位点。该位点有三种基因型,分别为CC、CT、TT,其中CC被确定为卵巢癌的风险基因型。当个体携带风险基因型时,
CDH1基因的转录水平下调,表达量降低,细胞粘附作用被削弱,细胞信号转导也减弱,使得癌细胞的分化降低、侵袭性升高、转移性增强,癌症的恶性程度也升高。
基质金属蛋白酶7基因(MMP7)是基质金属蛋白酶MMPs家族的成员之一,缺少MMPs家族中其他成员共有的c-末端血红素样结构。MMP7在正常卵巢组织中几乎不表达,而在卵巢癌及卵巢良性肿瘤中有较高的表达。这一结果提示,MMP7可能在卵巢肿瘤的发生发展中起着重要的作用。此外,MMP7有可能作为一种标志物,用于卵巢肿瘤的早期诊断并作为卵巢肿瘤治疗的靶点。A-181G位点是MMP7基因上-181位置的多态位点,与MM7基因的转录活性相关。该多态位点有三种基因型AA,AG,GG。其中,AG和GG基因型是卵巢癌的风险基因型。研究显示,-181G等位基因与MMP7的转录活性增加有关,引起MMP7表达增加,癌细胞外基质分解作用增强,癌细胞活动性增强,容易导致肿瘤细胞的扩散、转移以及肿瘤的血管生长。
荧光定量PCR是近几年来兴起的生物学技术,具有准确性高、重现性好等特点,已广泛用于基因表达研究、SNP位点分析等诸多领域,该方法采用完全闭管检测,省去了对PCR产物后处理,避免了交叉污染,结果判断有计算机完成,简化了操作步骤,并增加了结果的可靠性。是一种简便快速检测SNP
位点基因型的方法。
发明内容
本实用新型针的目的是提供一种采用荧光定量PCR技术同时检测四个卵巢癌遗传风险基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测四个SNP位点的荧光定量PCR反应液的四个试管、装有阳性对照品的一个试管、装有阴性对照品的一个试管组成,衬垫上设有容器孔,分别放置四管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。
其中荧光定量PCR反应液的成分主要包含PCR缓冲液、MgCh、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型一荧光探针、SNP位点基因型二荧光探针、TaqDNA聚合酶。
其中,
细胞色素P4501B1基因(CYP1B1)上的Leu432Val位点检测引物和探针为上游引物序列5,-GTGTTAAGTGAGAAGGTGAT-3'下游引物序列5'-AGGATAGCCAGGAAGAGAAA-3'
基因型一荧光探针序列5'-FAM-TATCGGTGAGAcCGTTGCCC-TAMRA-3'基因型二荧光探针序列5'-VIC-TATCGGTGAGAgCGTTGCCC-TAMRA-3'5,10-亚***四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的C677T位点检测引物和探针为上游引物序列5'-AAAGCTGCGTGA-3'下游引物序列5'-TGMGGAGAAGGTG-3'基因型一荧光探针序列5,-FAM-TCGaCTCCCGC-TAMRA-3'
基因型二荧光探针序列5,-VIC-ATCGgCTCCC-TAMRA-3'钙粘蛋白E基因(CDH1)上的C54T位点检测引物和探针为上游引物序列5'-AGAGCATCATCTGCGGCAT-3'下游引物序列5'-GGACCCTGGAGGCTGM-3'基因型一荧光探针序列5,-FAM-ACGTCtGTGGCCT-TAMRA-3,基因型二荧光探针序列5,-VIC-ACGTCcGTGGCC-TAMRA-3'基质金属蛋白酶7基因(MMP7)上的A-181G位点检测引物和探针为上游引物序列5'-TTACCACGAGCGCG-3,下游引物序列5'-GGTTTCCGGGGACC-3'基因型一荧光探针序列5'-FAM-CATGaGGACGG-TAMRA-3'基因型二荧光探针序列5'-VIC-CATGgGGACG-TAMRA-3'
对照品分为阳性对照品和阴性对照品,阴性对照品为无菌双蒸水样品,阳性对照品为口腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于-20'C,尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。
扩增检测在荧光定量PCR仪上进行,分为12个反应管,每一个SNP位点检测使用3个反应管,其中l个反应管为被检测样品,阳性对照和阴性对照各使用l个反应管,每管中总体积10ul,其中8ulPCR反应液,2ul检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为5(TC、2分钟,95'C、IO分钟,再进行60个循环的95。C、30秒,
60°C、1分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取,根据得到的二维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。
本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测被检测者对于卵巢癌的遗传得病风险和患病机理,从而指导被检测者选择正确的生活饮食****惯避免疾病的发生,对于已患病者可指导医师针对其患病机理选择正确的临床治疗方案,有利于患者进行个体化治疗。
本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测四个卵巢癌遗传风险基因SNP位点基因型的目的,相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点,本实用新型试剂盒将与同一疾病相关的四个SNP位点检测整合在一个试剂盒内,使用更方便而且成本更低,对卵巢癌遗传风险的结果分析也更便捷。
图1为本实用新型的结构示意图。
图2为细胞色素P4501B1基因上Leu432Val位点被检测样品的二维荧光图。
图3为5,10-亚***四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上C677T位点被检测样品的二维荧光图。
图4为钙粘蛋白E基因(CDH1)上C54T位点被检测样品的二维荧光图。
图5为基质金属蛋白酶7基因(MMP7)上A-181G位点被检测样品的二维荧光图。
图6为所有位点被检测样品的实时扩增曲线。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解,这些实施例仅用于说明目的,而不用于限制本实用新型范围。
实施例l
参见图l,本实用新型试剂盒由包装盒体1、衬垫2、装有检测四个SNP位点的荧光定量PCR反应液的四个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成,衬垫上设有容器孔,分别放置四管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。
其中荧光定量PCR反应液的成分主要包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型一荧光探针、SNP位点基因型二荧光探针、TaqDNA聚合酶。本试剂盒保存于-20'C,尽量减少反复冻融。
实施例2荧光定量PCR法同时检测四个卵巢癌遗传风险基因SNP位点基因型
血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司,TaqDNA聚合酶、dNTPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司,7900型荧光定量
PCR仪为美国ABI公司产品。
分别针对四个SNP位点设计荧光定量PCR引物和探针,根据引物和探针的设计原则以及基因组DNA序
5列情况,从中选择最佳组合。引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成。细胞色素P4501B1基因(CYP1B1)上的Leu432Val位点检测引物和探针为上游引物序列5'-GTGTTMGTGAGAAGGTGAT-3'下游引物序列5'-AGGATAGCCAGGAAGAGMA-3,
基因型一荧光探针序列5'-FAM-TATCGGTGAGAcCGTTGCCC-TAMRA-3'基因型二荧光探针序列5'-VIC-TATCGGTGAGAgCGTTGCCC-TAMRA-3'5,10-亚***四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的C677T位点检测引物和探针为上游引物序列5'-AAAGCTGCGTGA-3'下游引物序列5'-TGAAGGAGMGGTG-3'
基因型一荧光探针序列5'-FAM-TCGaCTCCCGC-TAMRA-3'基因型二荧光探针序列5'-VIC-ATCGgCTCCC-TAMRA-3'钙粘蛋白E基因(CDH1)上的C54T位点检测引物和探针为上游引物序列5'-AGAGCATCATCTGCGGCAT-3'下游引物序列5'-GGACCCTGGAGGCTGM-3'基因型一荧光探针序列5'-FAM-ACGTCtGTGGCCT-TAMRA-3'基因型二荧光探针序列5'-VIC_ACGTCcGTGGCC-TAMRA-3'基质金属蛋白酶7基因(MMP7)上的
A-181G位点检测引物和探针为上游引物序列5'-TTACCACGAGCGCG-3'下游引物序列5'—GGTTTCCGGGGACC-3'基因型一荧光探针序列5'-FAM-CATGaGGACGG-TAMRA-3'基因型二荧光探针序列5'—VIC-CATGgGGACG—TAMM-3'
选取30例女性血液样本,其中已确诊患上卵巢癌的为12例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为12个反应管,每管中总体积10ul,其中8ulPCR反应液,每一个SNP位点检测使用3个反应管,1个反应管中加入2u1被检测DNA,另外2个反应管中加入2u1阳性对照和阴性对照,在ABI7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50'C、2分钟,95°C、10分钟,再进行60个循环的95°C、30秒,6(TC、l分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。
被检测样本的细胞色素P4501B1基因上Leu432Val位点的二维荧光图参见图2,5,10-亚***四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上C677T位点的二维荧光图参见图3,钙粘蛋白E基因(CDH1)上C54T位点的二维荧光图参见图4,基质金属蛋白酶7基因(MMP7)上A-181G位点的二维荧光图参见图5,所有位点实时扩增曲线参见图6。