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专利名称:毛竹苯丙氨酸解氨酶、其编码基因及体外表达方法
技术领域:
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种苯丙氨酸解氨酶、其编码基因及应用,本发明还涉及该酶的体外表达方法。
背景技术:
苯丙烷类代谢途径是植物代谢中一条非常重要的途径,一切含苯丙烷骨架的物质都是由这一途径直接或间接生成。苯丙烷类代谢可生成类黄***、木质素等多种次生代谢产物,这些次生产物在植物的生长发育、抗病、抗逆反应中起着重要的作用,而苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase,PAL)是连接植物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶,是苯丙烷类代谢的关键酶。苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸的脱氨反应,使NH3释放出来,形成反式-肉桂酸,在植物体内次生物质(如木质素等)代谢中起着重要作用。近年来,越来越多的研究集中在苯丙氨酸代谢途径关键酶方面,以期通过调节这些酶的表达活性,来实现有效地调节与之相应的次级代谢产物的生物合成,培育出适合人类生产生活需要的植物新品种,如适于造纸的低木质素含量树种、高异黄***含量的大豆品种等。竹子作为我国重要的森林资源,由于竹材具有强度高、韧性好、硬度大等特点,在
建筑、造纸、装饰材料等领域得到广泛的应用。毛竹(Phyllostachysedulis)是我国重要的经济竹种之一,以毛竹为材料进行PAL基因的研究,对于更好地开发利用毛竹资源具有重要的现实意义。然而,竹子苯丙氨酸代谢途径的研究尚属空白。尚未有竹子苯丙氨酸解氨酶基因体外表达的报道,竹子苯丙氨酸代谢途径的分子基础还不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毛竹苯丙氨酸解氨酶、编码该酶的基因及应用。本发明的另一个目的在于提供体外表达上述毛竹苯丙氨酸解氨酶的方法。本发明从毛竹(Phyllostachysedulis)中克隆得到一种新的苯丙氨酸解氨酶基因(现将该基因命名为PePAL),,该基因全长为2503bp,分析表明,该序列包含一个完整的编码区2106bp,5'非翻译区(UTR)95bp,3'非翻译区274bp和polyA尾巴^bp,%,编码701个氨基酸组成的蛋白(苯丙氨酸解氨酶)。。,,第41450位为苯丙氨酸解氨酶保守域,在第185201位为苯丙氨酸解氨酶-组氨酸酶(PAL-histidase)信号,具备苯丙氨酸解氨酶的特征。实验表明由该基因编码的苯丙氨酸解氨酶在30°C、。为便于表述,将该苯丙氨酸解氨酶命名为
PePAL。应当理解,本领域技术人员可根据本发明公开的苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列(),在不影响其活性的前提下,取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸,得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段,将第675位的L替换为I。因此,、替换和/或增加一个或几个氨基酸,具有与PePAL同等活性的由PePAL衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外,应理解,考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性,本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而,、缺失和/或增加一个或几个核苷酸,得到编码PePAL的核苷酸序列。在本发明实例中,所述基因通过如下方法克隆获得从毛竹叶片中提取RNA,反转录成cDNA,通过RT-PCR的方法先克隆到T-easy载体上,并对筛选出的阳性克隆子进行测序克隆分析,发现插入片段与苯丙氨酸裂解酶基因家族的保守区有着较高的相似性。根据已获得保守区片断的序列设计引物,进行5'-RACE和3'-RACE扩增,将PCR产物回收、连接后转化,在得到的大量克隆中,选取阳性克隆进行测序。通过测序并与保守区序列拼接,去掉重叠部分,得到全长基因序列2503bpo可将本发明基因与表达载体可操作地连接,得到能够表达本发明蛋白的重组表达
载体,进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中,获得表达本发明PePAL的基因工程菌。本发明还提供PePAL的体外表达方法,其是通过培养上述基因工程菌,并诱导表达,获得PePAL。在本发明实例中,根据PePAL编码区序列设计包含酶切位点的引物,通过RT-PCR的方法先克隆到T-easy载体上,测序正确后将PePAL克隆到原核表达载体pGEX的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,优化条件,获得具有活性的苯丙氨酸解氨酶。实验表明,PePAL能够催化L-苯丙氨酸形成反式-肉桂酸。优选,-,加入IPTG至终浓度lmmol/L,37°C培养4小时,收集菌体,裂解后离心取上清,用组氨酸结合树脂纯化获得纯化苯丙氨酸解氨酶。在本发明实例中,待菌液生长至006(1(-,加入IPTG(终浓度lmmol-L"1)进行诱导培养。取诱导过的菌液250ml,5000rpm离心lOmin,收集细胞;加入9ml的BugBuster溶液、9μ1的Benzonase核酸酶、9μ1的Lysozyme,重悬细胞,室温下将细胞液在摇板上孵育15min;轻轻涡旋震荡,裂解细胞;4°C下1200g离心20min,取上清液按照IDAHisBind树脂纯化方法准备树脂柱(MERCK);将制备好的抽提物小心加到树脂柱的上方;分别用10倍床体积的IX结合缓冲液、6倍床体积的IX漂洗缓冲液、6倍床体积的IX洗脱缓冲液洗脱蛋白,获得纯化的蛋白溶液。本发明提供了一种新的苯丙氨酸解氨酶,其能够催化
L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸,具有较高的酶活性,为催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸提供了一种新的可选择途径。此外,本发明通过原核表达制备重组PePAL,克服了直接从竹子叶片中分离该蛋白的困难,降低了成本。
图1是保守区扩增及RACE产物电泳图。图2显示的是原核表达载体pGEX-PePAL的质粒载体。图3显示的是单克隆菌落PCR电泳结果,其中1-4单克隆菌落;5重组表达载体质粒;6:pGEX质粒;7:BL21菌液;8水;M=Ikb分子量标记。图4显示的是不同IPTG(·L^1Ummol·Λ·5mmol·L-1)诱导的PePAL重组蛋白的电泳图,其中1,3,5上清;2,4,6沉淀。图5显示的是基于G-250的BSA标准曲线。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1、毛竹色素结合蛋白基因PePAL序列的获得以毛竹(Phyllostachysedulis)幼嫩新鲜叶片为材料,提取RNA,并反转录成cDNA作为模板,根据公布的禾本科植物色素结合蛋白基因PAL家族的保守序列设计引物,PCR扩增编码区序列。上游引物
5‘-TGTCGACCAGCGTCAACGG-3‘下游引物5‘-ACTCTTCGTCGTCGTCGCTGAC-3‘对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,切下目的条带纯化回收,将回收的DN***段连接到pGEM-Teasy载体上,转化大肠杆菌(Esherichiacoli)DH5a感受态细胞,经蓝白斑筛选,提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后,再将单克隆测序,插入片段位1062bp,编码340个氨基酸。应用Blast在线软件,将测序的序列与已报道的基因进行同源比较,发现插入片段与苯丙氨酸裂解酶基因家族的保守区有着较高的一致性,%o根据已获得保守区片断的序列设计5'-RACE弓丨物PAL5-15'-ATCTCGTTGACCTTCTTGGCGTGGCTC-3‘;3'-RACE引物PAL3-15'-GCTCCAGTTCCTTGCCAACCCGATCAC-3‘PAL3-25'-CGTGTTCAGCTACGCCGACGACCCG-3‘引物PAL5-1和UPM的产物在1IOObp左右有一条亮带,而引物PAL3-1和UPM的产物电泳呈现弥散状态,没有特异性条带。将物PAL3-1和UPM的PCR产物稀释50倍作为模板,用引物PAL3-2与NUP配对进行扩增,电泳结果显示在SOObp左右有一条亮带(图1)。将PCR产物回收、连接后转化,在得到的大量克隆中,选取阳性克隆进行测序。通过测序并于保守区序列拼接,去掉重叠部分,得到脱氧核糖核苷酸序列全长为25(X3bp,包含一个完整的编码区2106bp,5'非翻译区(UTR)95bp,3'非翻译区
274bp和polyA尾巴^bp。通过blast软件在线比较分析,发现PePAL编码的氨基酸序列与其它单子叶植物的PAL具有较高的一致性,尤其与同是来自禾本科的水稻(OryzasativaL.)、玉
5(ZeamaysL.)>(SaccharumofficinarumL·)、zj、弗月土tt(BambusaventricosaMcClure)、绿竹(BambusaοldhamiiMunro)禾口小麦(TriticumaestivumL.)的PAL的一致性都在75%以上,其中与水稻的PAL(P14717)的一致性最高,%,与来自毛竹的LLBl(ABP96954)和PePALl(FJ195650)%%0由此可见,克隆出的PePAL基因为一全新的苯丙氨酸解氨酶基因。实施例2携带毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的重组表达载体的构建以毛竹cDNA为模板,根据序列1设计引物,PCR扩增毛竹苯丙氨酸解氨酶基因编码区的脱氧核糖核苷酸序列。引物两端分别引入EcoRI和NotI酶切位点,引物序列如下上游5'-ACGAATTCATGGCGGGCAACGGGCTC-3‘,引入EcoRI酶切位点下游5'-ATTGCGGCCGCTTAGTTGATGGGCAGGGG-3',引入NotI酶切位点对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,切下目的条带纯化回收,将回收的DN***段连接到pGEM-Teasy载体上,转化大肠杆菌(Esherichiacoli)DH5a感受态细胞,经蓝白斑筛选,提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后,再将单克隆测序,得到含有EcoRI和NotI酶切位点及编码毛竹苯丙氨酸解氨酶的脱氧核糖核苷酸
序列的质粒pT-PePAL。将质粒pT-PePAL和改造过的质粒pGEX(在GST前添加了His标签)37°C条件下分别用双酶切Mir,酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析,回收,用T4DNA连接酶4°C连接过夜。连接产物转化DH5a感受态细胞,挑取Amp抗性平板上长出的单克隆,提取质粒,进行PCR鉴定和酶切图谱鉴定。将获得的重组表达载体命名为pGEX-PePAL,重组表达载体pGEX-PePAL图如图2所示。实施例3重组表达载体转化宿主、阳性克隆鉴定将实施2中构建的重组表达载体pGEX-PePAL转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,挑取Amp抗性平板上长出的单菌落进行PCR鉴定。以PePAL基因重组表达载体的单克隆菌落为模板,用实施例2中引物进行PCR检测,同时以重组质粒、BL21(DE3)和水为对照。菌落PCR产物的电泳结果(图3)表明,单克隆菌落含有目的基因片段,可用于蛋白的诱导表达实验。实施例4PePAL基因的原核表达将实施3中鉴定正确的克隆培养过夜,再将细菌100倍稀释于含氨苄青霉素(IOOmg·Γ1)的LB培养基中培养,-,加入IPTG(·lAlmmol·Λ·5mmol·L-1)进行诱导培养。取诱导过的菌液250ml,5000rpm离心lOmin,收集细胞;加入9ml的BugBuster溶液、9μ1的Benzonase核酸酶、9μ1的Lysozyme,重悬细胞,室温下将细胞液在摇板上孵育
15min;轻轻涡旋震荡,裂解细胞;4°C下1200g离心20min,取上清入另一个新管中;沉淀用上样缓冲液溶解后,进行蛋白电泳分析。蛋白电泳结果(图4)表明,表达蛋白的分子量约为103KDa(包括His-)。实例5PePAL基因原核表达产物的纯化及其活性检测取实例4中获得的上清溶液,按照IDAHisBind树脂纯化方法准备树脂柱(MERCK);将制备好的抽提物小心加到树脂柱的上方;分别用10倍床体积的IX结合缓冲液、6倍床体积的IX漂洗缓冲液、6倍床体积的IX洗脱缓冲液洗脱蛋白,获得纯化的蛋白溶液。
6
按表1中所示反应体系加入各组分,30°C温育,振荡反应30min,然后分别加入200μ1HCl(6mol-L-1)终止反应。测定278nm吸光度值,(相当于Iml反应混合物中形成Iyg肉桂酸)。蛋白质量用考马斯亮蓝(G-250)法进行测定。考马斯亮蓝G-250是一种染料,在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0-1000yg范围内,蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比,用比色法建立标准蛋白BSA的标准曲线(图5)。表1PePAL活性检测
权利要求
,其氨基酸序列为a)
所示的氨基酸序列;b)、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
。
,。
。
,其为pGEX-PePAL。
。
,其为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.—种体外表达毛竹苯丙氨酸解氨酶PePAL的方法,其通过培养权利要求6或7所述的宿主细胞,诱导PePAL表达。
,其特征在于,所述宿主细胞为转化pGEX-PePAL重组载体的大肠杆菌BL21(DE3),-,加入IPTG至终浓度lmmol/L,37°C培养4小时,收集菌体,裂解后离心取上清,用组氨酸结合树脂纯化获得纯化苯丙氨酸解氨酶。
-苯丙氨酸生成反式肉桂酸中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种毛竹苯丙氨酸解氨酶PePAL,,