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毒素产生性艰难梭菌的检测方法.docx

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毒素产生性艰难梭菌的检测方法.docx

文档介绍

文档介绍:该【毒素产生性艰难梭菌的检测方法 】是由【421989820】上传分享,文档一共【23】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【毒素产生性艰难梭菌的检测方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。***产生性艰难梭菌的检测方法
***产生性艰难梭菌的检测方法
本发明提供一种能够特异性地且以高灵敏度检测***产生性艰难梭菌()的寡核苷酸、以及使用该寡核苷酸的***产生性艰难梭菌的检测方法。1)包括由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。2)包括由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
【专利说明】***产生性艰难梭菌的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于检测***产生性艰难梭菌(Clostridiumdifficile)的寡核苷酸和使用该寡核苷酸的***产生性艰难梭菌的检测方法。
【背景技术】
[0002]艰难梭菌()是产生对于人为病原性的菌体外***的芽胞形成革兰氏阳性杆菌。(CDAD)近年来成为很大的问题(非专利文献I)。即,抗生素或抗癌剂等的过度使用使正常的肠内细菌菌群受到损害,***
TcdA和TcdB,发生腹泻等症状。,经由器物或手等到达人的口或粘膜而感染。
[0003](LCTs)家族的
2种***TcdA和TcdB造成的,***产生性的不同,大致分为TcdA产生TcdB产生型(A+B+)、TcdA非产生TcdB产生型(A-B+)以及***非产生型(Α-B-)。另外,***产生体系据认为由tcdA和tcdB、以及编码它们的调节因子的tcdC,tcdR,tcdE构成的病原性座位形成,有报告当对***的产生进行负调控的tcdC缺陷时,***TcdA和TcdB产生亢进。
[0004]因此,仅选择性地检测***(A+B+和A_B+),(Clostridiumdifficileinfection:CDI)在临床诊断上很重要。
[0005]以往,对于***,报告了几条以***基因tcdA和tcdB为靶标的引物,能够使用这些引物从粪便提取DNA中检测该基因(非专利文献2—4、专利文献I)。
[0006]然而,,所以为了使用PCR检测粪便中的***产生株,需要构建具有更高的特异性和检测灵敏度这两者的检测体系,在该点上,可以说还不充分。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1:日本特开2003-164282号公报
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:Rupnik,M.,,.,:526-36
[0012]非专利文献2:Belanger,.,,,,.,:730-4
[0013]非专利文献3:Houser,.,,.,:719-26.[0014]非专利文献4:Sloan,.,,,.,:1996-2001
【发明内容】
[0015]发明所要解决的课题
[0016]本发明涉及提供能够特异性地且以高灵敏度检测***、以及使用该寡核苷酸的***。
[0017]用于解决课题的方法
[0018]本发明的发明人等鉴于上述课题,发现通过将20个菌株的tcdA基因序列、22个菌株的tcdB基因序列、以及作为索氏梭菌(Clostridiumsordelii)的***基因tcsL、作为诺氏梭菌(Clostridiumnovyi)的***基因tcnA和作为产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的***基因tcpL的碱基序列一起比对,设计得到特定的寡核苷酸,使用该寡核苷酸扩增tcdA基因和tcdB基因并测定,由此,能够特异性地且以优异的灵敏度检测***。
[0019]本发明涉及以下的I)~10)。
[0020]I)包括由序列号I所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
[0021]2)由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。
[0022]3)上述2)的寡核苷酸探针,其中,在寡核苷酸的5’末端结合有突光物质,在3’末端结合有粹灭物质。
[0023]4)具备上述I)的引物对和上述3)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。
[0024]5)包括由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。[0025]6)由序列号6所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。
[0026]7)上述6)寡核苷酸探针,其中,在寡核苷酸的5’末端结合有突光物质,在3’末端结合有猝灭物质。
[0027]8)具备上述5)的引物对和上述7)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。
[0028]9)一种***,其包括:以从人粪便提取的DNA为模板,使用上述4)或8)的寡核苷酸组分别进行PCR的工序;和通过测定荧光来测定扩增产物的工序。
[0029]10)******,其包括:以从人粪便提取的DNA为模板,使用上述4)和/或8)的寡核苷酸组、以及以下表示的(a)的引物对或具备(a)的引物对和(b)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组,分别进行PCR的工序;和通过测定荧光来测定扩增产物的工序。
[0030](a)包括由序列号7所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
[0031](b)由序列号9所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针,其中,在该寡核苷酸的5’末端结合有荧光物质,在3’末端结合有猝灭物质。
[0032]发明的效果
[0033]根据本发明的寡核苷酸和***,能够特异性地且以高灵敏度检测粪便中的***。因此,根据本发明,能够简易且准确地进行***,而且能够容易地调查健康***的粪便中的***。另外,,******。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1在TaqManPCR法中对于靶标菌的反应性(A:tcdA_F/R/P、B:tcdB-F/R/P)
[0035]图2在TaqManPCR法中对粪便中的靶标菌的检测灵敏度(A:tcdA_F/R/P、B:tcdB-F/R/P)
【具体实施方式】
[0036]本发明的引物对包括:(I)用于扩增tcdA基因的引物对和(2)用于扩增tcdB基因的引物对。
[0037](I)用于扩增tcdA基因的引物对包括作为由序列号I所示的碱基序列(5’-CAGTCGGATTGCAAGTAATTGACAAT-3’CtcdA-F))构成的寡核苷酸的第一引物、和作为由序列号2所示的碱基序列(5’-AGTAGTATCTACTACCATTAACAGTCTGC-3’CtcdA-R))
构成的寡核苷酸的第二引物。第一引物能够在PCR(聚合酶链式反应)等核酸扩增反应中作为正向引物使用,第二引物能够在核酸扩增反应中作为与第一引物组合的反向引物使用。
[0038](A+B+)、TcdA非产生TcdB产生型(A-B+)和***非产生型(A-B-),但已知tcdA***基因的有无和TcdA***产生的有无不一定一致。在使用现有公知的用于扩增tcdA基因的引物时,大多情况下不仅检测到A+B+型株,而且也检测到A-B+型`株,在该方法中,无法仅检测到TcdA***产生菌(参照实施例2(3))。对此,在使用本发明的包括第一和第二引物的引物对的情况下,如表3所示,仅A+B+型株中的tcdA被扩增,A-B+型株中的tcdA没有扩增。即,在使用本发明的用于扩增tcdA基因的引物对时,能够可靠地仅检测到TcdA***、即A+B+型株(参照实施例2(2)和(3))。
[0039](2)用于扩增tcdB基因的引物对包括作为由序列号4所示的碱基序列(5’-TACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGA-3’CtcdB-F))构成的引物的第三引物、和作为由序列号5所示的碱基序列(5’-CACCTATTTGATTTAGMCCTTTAAAAGC-3’(tcdB-R))构成的引物的第四引物。第三引物能够在核酸扩增反应中作为正向引物使用,第四引物能够在核酸扩增反应中作为与第三引物组合的反向引物使用。
[0040]通过使用该引物对,能够可靠地扩增tcdB基因,能够可靠地检测TcdB***、即A+B+型株和A-B+型株(表3)。
[0041]本发明的寡核苷酸探针包括:(1)与tcdA基因特异性地杂交的探针、和(2)与tcdB基因特异性地杂交的探针。
[0042](I)与tcdA基因特异性地杂交的探针为由序列号3所示的碱基序列(5’一TTGAGATGATAGCAGTGTCAGGATTG一3’(tcdA-Ρ))构成的寡核苷酸(第一探针),与由包括上述第一和第二引物的引物对的扩增范围特异性地结合。另外,(2)与tcdB基因特异性地杂交的探针为由序列号6所示的碱基序列(5’-TTTKCCAGTAAAATCAATTGCTTC—3’CtcdB-P))构成的寡核苷酸(第二探针),与由包括上述第三和第四引物的引物对的扩增范围特异性地结合。
[0043]这样的寡核苷酸探针通过将5’末端侧用FAM(羧基突光素,carboxyfluorescein)、TET(四***羧基突光素,tetrachlorocarboxyfIuorescein)等突光物质修饰,将3’末端用TAMRA(羧基四***罗丹明,carboxytetramethylrhodamine)、BHQ-l(黑洞粹灭剂-1,blackholequencher-1)等粹灭物质修饰,例如能够作为用于进行实时PCR的修饰寡核苷酸(所谓的Taqman探针)使用。
[0044]即,经修饰的第一探针与由上述第一引物和第二引物构成的引物对一起,能够作为用于利用实时PCR通过扩增、测定tcdA基因的寡核苷酸组使用,经修饰的第二探针与由上述第三引物和第四引物构成的引物对一起,能够作为用于利用实时PCR扩增、测定tcdB基因的寡核苷酸组使用。
[0045]本发明的寡核苷酸,除了由上述序列号I~6所示的碱基序列构成的寡核苷酸以外,还包括由与该各碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸。即,包括:由与序列号I和序列号2所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对、由与序列号3所示的碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针、由与序列号4和序列号5所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对、由与序列号6所示的碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。
[0046]另外,由在序列号I~6所示的碱基序列或与该碱基序列对应的互补序列中缺失、取代、添加或插入I或2个碱基的碱基序列构成的、且分别与由序列号I~6所示的碱基序列或其互补序列构成的寡核苷酸具有作为引物或探针相同的功能的寡核苷酸,也同样作为本发明的寡核苷酸。
[0047]本发明的寡核苷酸能够通过公知的化学合成法容易地制造。
[0048]本发明的上述各引物对优选与上述各寡核苷酸探针一起使用,以从人粪便提取的DNA作为模板进行核酸扩增反应,测定该扩增产物,由此能够分别检测
TcdA******。
[0049]其中,。此外,定量包括菌数的定量。
[0050]通过使用本发明的上述各引物对、优选与上述各寡核苷酸探针一起使用,能够测定粪便中的TcdA******,,,能够算出粪便中(肠内)、即***(A+B+型的菌数、A-B+型的菌数、或A+B+型和A-B+型的菌数的总和)、或非***(A-B-型的菌数)(A+B+型、A-B+型和A-B-型的菌数的总和)的存在比率。
[0051]、探针,可以列举以下所示的(a)的引物对或具有(a)的引物对和(b)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。
[0052](a)包括由序列号7所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
[0053](b)由序列号9所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针,其中,在该寡