植物耐逆性相关蛋白TaDREB4B及其编码基因和应用的制作方法.docx

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专利名称:植物耐逆性相关蛋白TaDREB4B及其编码基因和应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaDREB4B及其编码基因和应用。
背景技术:
干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响小麦生长、发育的障碍因子。因此,了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制,提高小麦品种的抗逆性,成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应,伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制,将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前,植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平,并与遗传学和遗传工程研究相结合,探索用生物技术来改进植物生长特性,其目的是提高植物对逆境的适应能力。在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下,植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整,以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达,这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答,而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径,从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、
渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物;第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子,如蛋白激酶、转录因子等。其中,转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。转录因子也称为反式作用因子,是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白,通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用,激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性,而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外,其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白,ethyleneresponsiveelementbindingprotein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basicregion/leucinezippermotiftranscriptionfactors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trpcluster)的MTO家族。这五个转录因子家族,除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外,其它四个家族均参与调节植物对干旱、
高盐和低温等的逆境胁迫反应。其中,AP2/EREBP类转录因子在高等植物中广泛存在,它是植物所特有的一类转录因子,近年来,在拟南芥、烟草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有报道,这表明AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。DREB(脱水应答元件结合蛋白,DRE-bindingprotein)类转录因子是AP2家族中EREBP-Iike亚家族中的一个成员。DREB和EREBP类转录因子在氨基酸序列上没有显著的相同性,但都含有一段非常保守的由58个左右氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2结构域)。蛋白质三维分析表明,该区域含有3个折叠,对识别各类顺式作用元件起关键作用。其中位于第二个折叠中的第14、19位的两个氨基酸残基的差异,决定这类转录因子与不同顺式作用元件的特异结合。DREB类转录因子第14位氨基酸是缬氨酸(V14),第19位氨基酸是谷氨酸(Ε19),其中第19位的氨基酸并不保守,例如水稻的OsDREBI转录因子的第19位氨基酸就是缬氨酸(DubouzetJG,SakumaY,ItoY,KasugaM,DubouzetEG,MiuraS,SekiΜ,ShinozakiK,Yamaguchi-ShinozakiK,2003)在DREB相关蛋白中决定DNA结合的特异性方面,V14的作用明显要比Ε19重要(SakumaY,LiuQ,DubouzetJG,AbeH,ShinozakiKandYamaguchi-ShinozakiK,2002);而ERF类转录因子第14位氨基酸是甘氨酸,第19位是天冬氨酸,因而DREB特异结合
DRE/CRT顺式元件,ERF特异结合GCC-盒。AP2/EREBP结构域的C-端区还包含1个由18个氨基酸残基组成的核心序列,该序列形成双亲性的α-螺旋,该α-螺旋可能参与同其它转录因子及DNA间的相互作用。目前,在许多植物中都发现含有EREBP/AP2结构域的转录因子,并分别与抗病、抗逆等信号传递有关(刘强,赵南明,Yamaguchi-SiinozakiK,ShinozakiK,2000)刘强等认为,一个DREB基因可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达(刘强,赵南明,Yamaguchi-ShinozakiK,ShinozakiK,2000)Kasuga等的研究证实,导入到拟南芥的DREBlA基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的基因rd29、rdl7、kinl、、corl5a以及erdlO的表达,转基因植株的抗逆性大大增强(KasugaM,LiuQ,MiuraS,Yamaguchi-ShinozakiK,ShinozakiK.,1999)。同样,低温耐性转录因子CBFl的转基因植株的耐低温能力有显著提高(Jaglo-OttosenKR,GilmourSJ,ZarkaDG,SchabenbergerO,ThomashowMF.,1998)。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状,依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此,利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达,从而增强植物的抗逆性,已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。根据含DNA结合区的数目,AP2/EREBP转录因子分为AP2(APETALA2)和乙烯应答元件结合蛋白
EREBP(ethylene-responsiveelementbindingprotein)以及RAV三个大类型。AP2型转录因子包括拟南芥的AP2、ANT,玉米的Glossy、idsl等。这种类型的转录因子含有两个AP2/EREBP结构域,调节细胞的生长发育,在拟南芥中已发现14个AP2型转录因子基因;EREBP型转录因子仅含1个AP2/EREBP结构域,调节植物对激素(乙烯)、病原、低温、干旱及高盐等地分子应答反应。EREBP型转录因子中,已发现有烟草EREBP1-4、番茄Pti4-6、拟南芥RAV1-2、AtEBP、AtERF1-5、DREBlA-C(CBF1-3)和DREB2A-B等许多成员,分别与细胞发育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号传递有关。这些EREBP型转录因子又可以再分为EREBP(ethylene-responsiveelementbindingprotein,艮口ERF)亚组,包括烟草EREBP1-4、番茄Pti4-6、拟南芥AtEBP、AtERFl_5、这类转录因子与含核心序列AGCCGCC的GCC-盒特异结合,因此,它的DNA结合区又称为GCC-盒结合域(GCC_boxbindingdomain,GBD),其中第2个G、第5个G、第7个C对ERF蛋白的识别有重要作用(HaoD,Ohme-TakagiM,SaraiA,1998)。用核磁共振对其三维空间结构的研究表明,AtERFl的GBD通过形成3个反向的β-片层与其靶序列GCC-盒的大沟相结合;DREBP亚组,包括拟南芥DREBlA-C(CBFlD和DREB2A-B,这类转录因子在干旱、高盐、低温下特异结合干旱应答元件DRE/CRT,在拟南芥基因组中发现
IM个DREBP型转录因子基因;RAV型转录因子包括拟南芥RAVI、RAV2、含有两个不同的DNA结合区-ERF/AP2和B3,在拟南芥中已发现6个RAV型转录因子基因。还有一类特殊的转录因子AL079349,它与以上的转录因子都不同,自
成一类。最近发现EREBl5s蛋白参与了干旱、高盐和低温胁迫的信号传导和基因表达调控。Mine等人从低温储藏的土豆块茎中分离到了EREBP转录因子CLP353,受低温胁迫诱导强烈表达(MineΤ,HiyoshiΤ,KasaokaK,OhyamaΑ,2003),说明可能有EREBP蛋白参与了受低温胁迫的基因表达调控。Park等利用西红柿为材料,得到了受高盐、乙烯或茉莉酸诱导表达的EREBP转录因子iTsi基因,EMSA(Electrophoreticmobilityshiftassays)试验分析发现,Tsi蛋白与GCC-box和DRE/CRT顺式元件都能结合(ParkJM,ParkCJ,LeeSB,HamBK,ShinR,PaekKH,2001),尽管前者结合能力大于后者,但说明,某些EREBP蛋白能激活受渗透胁迫诱导表达的基因。在正常生长条件下,Tsi基因的超量表达提高了转基因植株(35S::Tsil)的耐盐性、增强了抗病性(ParkJM,ParkCJ,LeeSB,HamBK,ShinR,PaekKH,2001),以上说明了Tsi基因可能参与了生物胁迫和非生物胁迫两条信号传导途径。由高盐胁迫激活的一条类MAPK信号传递模式(包括SIMKK和SIMK),将胁迫信号传递给EIN2(在乙烯信号传递途径的CTRl下游)(GuoHWandEckerJ
,2004),最后激活某些EREBI3s转录因子,调控渗透胁迫相关基因的表达,提高植物的耐盐性。对于是否存在含GCC-box元件,且表达产物直接参与非生物胁迫响应的基因,还有待作进一步的证实。综合目前的研究结果,植物在逆境胁迫条件下的信号传递途径至少有以下六条途径(1)依赖于ABA的信号传递途径有三条受干旱、高盐诱导,激活MYB、MYC类转录因子基因,调控具有MYBR或MYCR顺式作用元件的靶基因;受干旱、高盐诱导,激活ABF/AREB类转录因子基因,调控具有ABRE顺式作用元件的靶基因;受干旱、高盐诱导,激活CBF4,DREB1类转录因子基因,调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。(2)不依赖于ABA的信号传递途径有三条受干旱、高盐诱导,激活DREB2类转录因子基因,调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因;受低温诱导,激活CBF1-3/DREB1A-C类转录因子基因,调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因;受干旱、高盐或乙烯诱导,激活ERF类转录因子基因,调控具有DRE/CRT或GCC顺式作用元件的靶基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaDREB4B及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质,为一种脱水应答元件结合蛋白,来源于小麦属小麦(TriticumaestivumL·),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。序列1所示蛋白质由346个氨基酸残基组成,自氨基端第沈位-33位氨基酸残基序列和第63位-67位氨基酸残基序列为两个可能的核定位信号区,自氨基端第89位-147位氨基酸残基序列为保守的AP2/EREBP结构域。为了使(a)中的TaDREB4B便于纯化,可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的TaDREB4B可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得至IJ。上述(b)中的TaDREB4B的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子1)序列表中序列2自5,端第1至1168位核苷酸所示的DNA分子;2)序列表中序列2自5,端第1至1193位核苷酸所示的DNA分子;3)序列表中序列2所示的DNA分子;4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA
序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子;5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。()、%SDS的溶液中,65°C条件下杂交并洗膜。序列2所示cDNA序列由1494个核苷酸组成,该基因的开放阅读框架为自5'端第1位-1168位核苷酸。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域,即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DN***段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端,如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子,如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子⑴biquitin),它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读
框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选择性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为YEP-GAP-TaDREB4B、pBI121_TaDREB4B或pAHC25-TaDREB4B;所述YEP-GAP_TaDREB4B为将所述基因插入YEP-GAP的多克隆位点得到的重组质粒。所述YEP-GAP-TaDREB4B优选为将序列表的序列2自5,端第1至1193位核苷酸所示的DN***段插入YEP-GAP的EcoRI和BioI酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述pBI121_TaDREB4B为将所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒。所述pBI121-TaDREB4B优选为将序列表的序列2自5,端第1至1193位核苷酸所示的DN***段插入pBI121的BamHI和BioI酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述pAHC25_TaDREB4B为将所述基因插入pAHC25的多克隆位点得到的重组质粒。所述pBI121-TaDREB4B优选为将序列表的序列