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植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC14及其编码基因与应用的制作方法
本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC14及其编码基因与应用。实验证明,将序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的GmNF-YC14基因的重组表达载体pAHCPSK-GmNF-YC14转化拟南芥得到的T3代纯合转基因植株,%-%,%%;%-%,%%。本发明所提供的GmNF-YC14蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义。
【专利说明】植物耐逆性相关蛋白GmNF-YCM及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】中的一种耐逆性相关的蛋白及其编码基因和应用,特别是一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC14及其编码基因与应用,该蛋白质GmNF_YC14来源于大豆,具有提高植物耐旱性和耐盐性的能力。
【背景技术】
[0002]干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重制约着大豆的生长、发育。因此,了解大豆对逆境条件的应答与信号传导机制,提高大豆品种的抗逆性,成为大豆遗传研究及品种改良的重要任务之一。
[0003]在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应,伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制,将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前,植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平,并与遗传学和遗传工程研究相结合,探索用生物技术来改进植物生长特性,其目的是提高植物对逆境的适应能力。
[0004]在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下,植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整,以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达,这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答,而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径,从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类:第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物;第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子,如蛋白激酶、转录因子等。其中,转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
[0005]转录因子也称为反式作用因子,是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白,通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用,激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性,而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外,其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。
[0006]目前已知在植物中与胁迫相关`的转录因子主要有:具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答兀件结合蛋白,ethyleneresponsiveelementbindingprotein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basicregion/leucinezippermotiftranscriptionfactors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、结合CCAAT-box的主要核转录因子的CBF(CCAATbindingfactor)类转录因子、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trpcluster)的MYB家族。
[0007]NF-Y是一类结合顺式作用元件CCAAT-box的转录因子,特异的识别并结合许多真核生物组成型、诱导性和细胞周期依赖性基因的启动子或增强子中的顺式作用元件CCAAT-box,进而在转录水平调控这些基因的表达。NF-Y是由
NF_YA、NF_YB和NF-YC三个不同亚基组成的杂合三聚体。NF-YB蛋白与NF-YC蛋白通过彼此的HFM保守域,采用头尾相接的方式形成异源二聚体互作平台,吸引NF-YA蛋白结合到这个二聚体平台从而形成具有活性的异源三聚体核转录因子。NF-Y通过NF-YA亚基上的DNA结合域结合到靶基因启动子部分的CCAAT盒,执行转录激活或转录抑制功能。NF-Y的三个亚基的保守域分别具有不同的蛋白结构域,其中NF-YA保守域具有DNA结合结构域(DNAbindingdomain)和与NF-YB/C异源二聚体互作结构域(subunitinteractiondomain)。NF-YB和NF-YC蛋白保守域则由组蛋白折叠基序(Histone-foldmotif)构成。其中NF-YB与H2B组蛋白折叠基序相似,而NF-YC与H2A组蛋白折叠基序相似,组蛋白基序由三个a螺旋和两个环组成,负责H2A/H2B二聚体的形成。[0008]由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状,依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此,利用一个关键转录因子促进多个功能基因的表达,增强植物的抗逆性,已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmNF_YC14及其编码基因与应用。
[0010]本发明所提供的与植物耐逆性相关蛋白,来源于大豆(GlycinemaxL.),是一种结合CCAAT-box的核转录因子蛋白名称为
GmNF-YC14,该蛋白质是如下a)或b)的蛋白质:
[0011]a)由序列表序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
[0012]b)将序列表序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下至少一种植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质:耐旱性和耐盐性。
[0013]序列表序列I所示的氨基酸序列由166个氨基酸残基组成,第16位至第79位的氣基酸序列为保守的组蛋白折置基序。
[0014]为了使上述(a)中的蛋白便于纯化,可在由序列表序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015]表1标签的序列
[0016]
标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL
[0017]上述(b)中的蛋白可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2中第21-521位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018]编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
[0019]所述蛋白质的编码基因为如下I)或2)或3)或4)的基因:
[0020]I)其核苷酸序列是序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的DNA分子;
[0021]2)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子;
[0022]3)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子;
[0023]4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0024]序列表序列2由580个脱氧核糖核苷酸组成,是大豆GmNF_YC14蛋白的全长cDNA序列,其中的第21位至第521位为开放阅读框。
[0025]所述严格条件可为如下:50°C,在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、,在50°C,2XSSC,%SDS中漂洗;还可为:50°C,在7%SDS,,在50°C,IXSSC,%SDS中漂洗;还可为:50°C,在7%SDS,,在50°C,,%SDS中漂洗;还可为:50°C,在7%SDS,
的混合溶液中杂交,在50°C,,%SDS中漂洗;还可为:50°C,在7%SDS,,在65°C,,%SDS中漂洗;也可为:在6XSSC,%SDS的溶液中,在65°C下杂交,然后用2XSSC,%SDS和IXSSC,%SDS各洗膜一次。
[0026]含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。
`[0027]可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pR0KI1、pBin438、pCAMBIA1302、PCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa或pCAMBIA1391_Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域,即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DN***段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端,如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子
),它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因,赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因,赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因,和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
[0028]含有所述基因的所述重组载体具体可为YEP-GAP-GmNF-YC14或pAHCPSK-GmNF-YC14;
[0029]所述YEP-GAP-GmNF-YC14可为将所述基因插入载体YEP-GAP得到表达所述蛋白的重组表达载体;具体可为将序列表序列2中第21位至第518位核苷酸序列所示的DNA分子插入载体
YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切位点之间得到的重组表达载体;
[0030]所述pAHCPSK-GmNF-YC14可为将所述基因插入载体pAHCPSK得到表达所述蛋白的重组表达载体;具体可为将序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的DNA分子插入载体pAHCPSK的SmaI和SpeI酶切位点之间得到的重组表达载体。
[0031]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0032]本发明所述的培育转基因植物的方法是将所述基因导入目的植物中,得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
[0033]在上述方法中,所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。
[0034]在上述方法中,所述双子叶植物具体可为拟南芥。
[0035]在上述方法中,所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。
[0036]本发明保护所述蛋白在作为转录因子中的应用。
[0037]实验证明,将序列表序列2中第21位至第521位核苷酸序列所示的GmNF_YC14基因的重组表达载体pAHCPSK-GmNF-YC14转化拟南芥得到的T3代纯`合转基因植株,在耐旱性实验中(将正常生长萌发15天的幼苗不浇水,直至野生型植株枯萎时,再复水一周)%-%,而野生型植株和转空载体植株的存活率分别为
%%;在耐盐性实验中(将正常生长萌发15天的幼苗浇IOOmMNaCl水溶液,直至野生型植株枯萎时,再复水一周)%-%,%%o
[0038]本发明所提供的GmNF_YC14蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义,为人为控制抗逆相关基因的表达提供了基础,将在培育高抗逆性如强耐旱性和强耐盐性植物品种中发挥重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为实时荧光定量PCR分析不同胁迫处理下GmNF_YC14基因的表达图谱。其中,A-F依次分别为脱落酸、干旱、低温、高温、盐溃和乙烯的胁迫处理,横坐标为胁迫的时间,纵坐标为GmNF-YC14基因的相对表达量。
[0040]图2为酵母单杂交系统证明转录因子体内结合特异性和激活特性的原理示意图。
[0041]图3为重组载体pAHCPSK-GmNF-YC14的结构示意图。
[0042]图4为转基因拟南芥植株cDNA水平的PCR鉴定电泳图。其中,泳道M为分子量标准,从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp,泳道C为哥伦比亚生态型拟南芥Col-0,泳道1-5为待鉴定植株,具有预期条带的为转基因植株。