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专利名称:植物免疫组合物的制作方法
技术领域:
本发明一般地涉及植物免疫,更具体地,涉及能在植物中诱导针对植物致病性微生物,例如植物致病性真菌的抗性的组合物和方法。
背景技术:
各种研究表明,植物对某些疾病的易感性与缺少对这些疾病的遗传性抗性机制的潜力并不一致。事实上,众所周知,通过以下方式,可在明显易感性植物中诱导抗性,这些方式包括免疫接种植物病原体的无毒性形式和低毒植物病原体,或用植物病原体限制性免疫接种。得到诱导的抗性是持久的,并且一般对病原体是非特定性的。
这种防御系统是早期致病性识别事件复杂的相互作用,识别事件产生信号从细胞内、细胞间免疫位置传递到整个植物体。这些信号借助阻断甚至杀死入侵病原体引发一系列的可诱导的防御反应。许多防御反应由基因转录水平控制。
病原体检测在尽可能靠近植物表面的地方进行。侵袭病原体的细胞壁降解产物(葡聚糖激发物)和受侵袭的植物细胞的片段(oligogalacturonide激发物)都是最佳描述的警戒信号。二次信号从受侵袭部位传遍整个植物体。文献引述最多的信号链中的化合物是水杨酸,但电信号也已被描述为防御诱导信号。
通过产生警戒信号激活的防御反应覆盖很宽的范围,包括化学、生化和机械防御。在单子叶植物常常观察到,在与病原体试图侵入的位点相应的地方,通过胼胝质堆积强化细胞壁。在单子叶和双子叶植物中观察到水解酶(例如,有溶菌酶活性的壳多糖酶,β-1,3-葡聚糖酶,蛋白水解酶)的诱导。植物体可以通过以局部地高度升高的浓度合成具有毒性的次生代谢产物,即所谓的植物抗***,应答,植物抗***能够杀死侵入的微生物。受到攻击的植物细胞的最早反应之一是产生活性氧自由基,这常常是完全牺牲侵入部位周围有限数量细胞的开始。
发明概述令人惊奇的是,已经发现来自一般对任何植物都不致病的微生物(非植物致病性微生物)的生物物质提取物,可以被用来在植物中诱导对植物致病性微生物的抗性。
因此,本发明提供了一种能在植物中诱导对植物致病性微生物抗性的制剂,其中这种制剂是来自非植物致病性微生物的生物物质提取物,该提取物通过以下步骤得到a)每升无机或有机溶剂中悬浮50克到200克(干重)来自非植物致病性微生物的生物物质;b)室温下搅拌1至12小时;c)温育;d)重新悬浮;e)使其冷却至室温;以及f)选择性地,过滤。
(此后称“本发明的制剂”)本发明还提供了农用组合物,包括用上述步骤可获得的制剂,结合农业上可接受的载体材料
(稀释剂),以及选择性地一种或多种能在植物中诱导对植物致病性微生物抗性的植物农药。
根据本发明,还提供了一种来自产黄青霉的,能够在植物中诱导对植物致病性微生物抗性的提取物。
本发明进一步提供通过给植株、土壤或种子施用本发明制剂,在植物中诱导对植物致病性微生物抗性的方法。这种制剂可以以非配制的形式,或农用组合物形式使用。
本发明还提供了生产在植物中诱导对植物致病性微生物抗性的制剂的方法,其中该制剂是来自非植物致病性微生物的生物物质提取物,该提取物通过以下步骤得到a)每升无机或有机溶剂中重新悬浮50克到200克(干重)来自非植物致病性微生物的生物物质;b)室温下搅拌1至12小时;
c)温育;d)重新悬浮;e)使其冷却至室温;以及f)选择性地,过滤。发明详述此处所用的“植物”,我们是指典型的栽培植物,即种植以生产可收获的产品。在本发明范围内,通过导入抗性以得到保护的目的植物包括,例如,以下植物品种谷类植物(小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、高粱以及相关农作物),甜菜(蔗糖甜菜和饮料甜菜),核果,梨果和小果(苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓和欧洲黑莓),豆科植物(豆子、扁豆、豌豆和大豆),油类植物(油菜、芥子、***、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻、可可豆、花生),藤类植物(黄瓜、葫芦和瓜),纤维植物(棉花、亚麻、***、黄麻),柑桔类植物
(橙、柠檬、葡萄和桔),蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、大蒜、西红柿、马铃薯和胡椒),月桂科(鳄梨、肉桂和樟脑),或者诸如玉米、烟草、坚果、咖啡、糖甘蔗、茶叶、藤本植物、啤酒花、香蕉和天然橡胶树的植物;以及观赏植物,草地(草皮)和堤岸植物。
优选地,根据本发明保护的植物包括茄科如西红柿,马铃薯,豆子,黄瓜,胡椒,烟草,花生和葡萄藤。
特别优选地,根据本发明保护的植物包括茄科植物。
此处使用的“植物致病性微生物”,我们是指能够侵袭植物并对其造成损害的真菌、细菌和病毒。本发明制剂在诱导对植物致病性真菌抗性中特别有效。这些植物致病性真菌包括,例如,致病疫霉(Phytophthorainfestans),黄枝孢(Cladosporiumfulvum),葡萄生单轴霉(Plasmoporaviticola),芦芦科刺盘孢(Collectotrichumlagenarium),Pseudomonaslachrymans和Puccinlatritici。
用本发明制剂在抵抗致病疫霉和黄枝孢保护茄科植物如西红柿、马铃薯和抵抗葡萄生单轴霉保护葡萄及抵抗葫芦科刺盘孢和Pseudomonaslachrymans保护黄瓜中取得尤其好的效果。
此处使用的“非植物致病性微生物”,我们是指那些在植物中不引起疾病的微生物属和种类。优选地,非植物致病性微生物也是非植物特异性的微生物,即它们不在植物上生长。
根据本发明可以使用的微生物属的例子包括细菌醋杆菌属,无色菌属,放线菌属,气杆菌属,产碱菌属,节杆菌属,芽孢杆菌属,短杆菌属,Cephalosporium,梭状芽孢杆菌属,棒杆菌属,隐球菌属,埃希氏菌属,黄杆菌属,葡糖杆菌属,乳杆菌属,明串珠菌属,甲烷杆菌属,甲烷单胞菌属,***弧菌属,小细菌属,小球菌属,小单孢菌属,分枝杆菌属,诺卡氏菌属,丙酸杆菌属,精朊杆菌属,变形杆菌属,假单胞菌属,红假单胞菌属,糖多孢菌属,八叠球菌属,孢子丝菌属,链球菌属,链霉菌属,高温单孢菌属,硫杆菌属,黄色单胞菌属。
真菌和酵母Acremonium,座壳孢属,阿舒囊霉属,曲霉属,短梗霉属,白僵菌属,假丝酵母属,麦角属,斜盖伞属,弯孢霉菌,柱霉属,假囊酵母属,伊文氏杆菌属,镰孢霉属,梭链孢属,赤霉属,汉逊酵母属,Hirsutella,克鲁维酵母菌属,绿僵菌属,毛霉属,Myocandida,新赤壳属,Phaecilomyces,青霉属,Pericularia,Phanerochaete,须霉属,毕齐酵母属,发芽微菌属,根霉属,酵母属,裂殖酵母属,Sesquicilliopsis,Streptomyxa,Tolypocladium,色串胞属,球拟酵母属,栓菌属,木霉属,三角酵母属。
根据本发明可以使用的特定的种类包括细菌醋化醋杆菌,弱氧化醋杆菌,木醋杆菌,Achromobacterobae,密苏里游动放线菌,产气气杆菌,粪产碱菌,
Arthrobacterhyalinus,石蜡节杆属,Arthrobactersimplex,酸热芽孢杆菌,解淀粉芽孢杆菌,溶解淀粉芽孢杆菌,短芽孢杆菌,热溶芽孢杆菌,蜡状芽孢杆菌,环状芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,坚强芽杆菌,迟缓芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌,多粘芽孢杆菌,日本甲虫芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,Brevibacteriumamylolyticum,黄色短杆菌,乳发酵短杆菌,***丁醇梭菌,丁酸梭菌,Corynebacteriumgelatinosum,谷氨酸棒杆菌,Corynebacteriumguanofaciens,解烃棒杆菌,嗜石油棒杆菌,Cryptococcuslaurentii,大肠杆菌,产氨黄杆菌,生黑葡糖杆菌,Lactobacillusbulgaris,德氏乳杆菌,瑞士乳杆菌,乳乳杆菌,戊糖乳杆菌,Leuconostocbrevis,肠膜明串珠菌葡聚糖亚种,肠膜明串珠菌,Methanobacillusomelianski,Methanobacillussoenhngenii,Methanomonasmargaritae,Methanomonascapsulatus,甲烷假单孢菌,索氏***弧菌,嗜氨微杆菌,谷氨酸微球菌,炭样小单孢菌,棘孢小单孢菌,伊纽小单孢菌,橄榄星孢小单孢菌,绛红小单孢菌,草分枝杆菌,包皮垢分枝杆菌,Nocardiaalkanoglutinosa,加德纳诺卡氏菌,地中海诺卡氏菌,灰暗诺卡氏菌,费氏丙酸杆菌,谢氏丙酸杆菌,红色精朊杆菌,雷氏普罗威登斯菌,淀粉皮假单胞菌,致金色假单胞菌,德阿昆
哈假单胞菌,脱氮假单胞菌,***养假单胞菌,卵状假单胞菌,吡咯菌素假单胞菌,类球红细菌,红色糖多孢菌,藤黄八叠球菌,Sporotrichumpulverulentum,乳酸乳球菌,Strepotococcusfradiae,乳链球菌,变异链球菌,唾液链球菌嗜热亚种,链霉菌属所有种类,弯曲高温单孢菌,褐色高温单孢菌,氧化亚铁硫杆菌,氧化硫硫杆菌。
真菌和酵母Acremoniumchrysogenum,粉虱座壳孢,棉阿舒囊霉、泡盛曲霉,黄曲霉,解乌头酸曲霉,米曲霉,酱油曲霉,土曲霉,温特曲霉,出芽短梗霉,白僵菌,Beauveriainflatum,Candidaflaveri,解脂假丝酵母,Candidaoleophila,Candidapericulosa,热带假丝酵母,产朊假丝酵母,顶头孢,雀稗麦角,Clavicepsfusiformis,Clitopiluspasseckerianus,弯孢、Cyclindrocarponradicicola,阿舒假囊酵母,异常汉逊酵母,Hirstutellathompsonii,脆壁克鲁维酵母,乳酸克鲁维酵母,绿僵菌,米黑毛霉,微小毛霉,Myocandidaribofiavina,侵菅新赤壳,Phaecilomycesvarioti,产黄青霉,沙门柏干酪青霉,Penicilliumgriseofulvum,娄地青霉,展青霉,Phanerochaetechrysosporium,布拉克须霉,季也蒙毕赤酵母,树干毕赤酵母,Pullulariapullulans,Rhizopusdelemar,台湾根霉,日本根霉,Rhizopusnigricans,雪白根霉,酿酒酵母,卡尔酵母,鲁酵母,
Saccharomyceslipolytica,粟酒裂殖酵母,Sclerotiumglutanicum,Sesquicilliopsisrosariensis,Streptomyxaaffinis,Tolypocladiuminflatum,Tolypocladiumterricola,Torulacremovis,木兰球拟酵母,Torulopsisutilis,血红栓菌、三角酵母。
非植物致病性微生物优选真菌或酵母,但尤其选择真菌。
特别优选的真菌种类属于以下属和种Acremonium属种类如AcremoniumChrysogenum,曲霉属种类如泡盛曲霉,解乌头酸曲霉,短梗霉属种类如出芽短梗霉,白僵菌属种类如Beauveriabassiana,Beauveriainflatum,斜盖伞属种类如Clitopiluspasseckerianus,毛霉属种类如米黑毛霉,微小毛霉,新赤壳属种类如侵菅新赤壳,Phaecilomyces种类如Phaecilomycesvarioti,青霉属种类如产黄青霉,沙门柏干酪青霉,桔青霉,Penicilliumgriscofulvum,娄地青霉,Penicilliumurticae,展青霉,Phanerochaete属种类如Phanerochaetechrysosporium,发芽微菌属种类如Pullulariapullmans,裂殖酵母属种类如粟酒裂殖酵母,Tolypocladium属种类如Tolypocladiuminfiatum,Tolypocladiumterricola,栓菌属种类如血红栓菌,木霉属种类如康宁木霉,Trichodermareseei,绿色木霉。
根据本发明可以使用的更优选的微生物属于青霉属和头孢属,其中产黄青霉和顶头孢是特别优选的。
此处使用的“生物物质(biomass)”指的是在为例如生产药剂如抗生素的生物技术发酵过程中得到的干燥的有机废品。在收集的时候,湿的微生物生物物质经过过滤从液体中分离,例如含抗生素相,并且例如在130到150℃下,4到6小时时间干燥。这种干燥的有机废品现在可作为生产本发明制剂的起始材料。
优选地,起始材料是来自生物技术发酵过程的废品的,优选地来自产黄青霉和顶头孢发酵的真菌生物物质(菌丝体)。
适合作为提取过程步骤(a)和(d)的无机溶剂的优选例子是水。适合作为步骤(a)和(d)的有机溶剂的优选例子是醇类,例如异丙醇,乙烯醇或甲醇。
通常使用浓度为每升溶剂中50到200克(干重)来自非植物致病性微生物的生物物质。优选地每升溶剂中悬浮大约150克(干重)生物物质。
从步骤(a)得到的悬浮液在没有进一步调整时,-,。此悬浮液一般在室温下(+20~+25℃)搅拌1到12小时[步骤(b)]。
步骤(c)的典型温育条件是,例如在+120℃1小时,+80℃2小时,+20℃12小时。由此,最高温度是+120℃,最低温是+20℃。在+120℃时,温育期时间不应超过2小时,;而在+20℃时,温育期最短时间应是8小时,最长时间是70小时。本领域技术人员将知道在所给的+120℃
和+20℃之间的任一温度下,如何确定温育期的最短和最长时间。优选地温育在同时加热和高压灭菌的情况下进行,例如+120℃1小时(由此路线得到的提取物此后称为提取物PEN-A)或在+80℃2小时。在20℃温育12小时得到的提取物称为提取物PEN-B。
步骤(d)中重新悬浮典型地通过震荡进行或混合步骤(c)中可能已分离或固体和液体成分的悬浮液。
步骤(e)当然是在使用的温育温度高于室温时才需要。
步骤(f)中的过滤典型地通过滤纸进行,得到褐色的澄清溶液并有发酵产物典型的气味。此过滤步骤也可通过间断式或连续离心,或采用压滤器以工业规模进行。过滤步骤尤其用来减少植物毒性的危险。本发明优选制剂是通过包括过滤步骤(f)的步骤得到。
根据本发明,在步骤(e),或优选地过滤步骤(f)之后,提取物适当干燥,这样可以以粉末形式包装和运输,并被最终使用者重新悬浮使用。干燥条件并不关键,已知的方法如冻干法,喷干法或旋转干燥法都可使用。
提取方法的改变将导致所需植物保护剂的活性严重丧失和/或引起提取物严重的植物毒性副作用。
本发明制剂典型地包含以下活性成份1)聚合程度在2到30之间甚至更大的支链或非支链低聚糖,2)单糖类,和3)蛋白,糖蛋白和/或脂蛋白。