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专利名称:标记基因的制作方法
技术领域:
本发明涉及标记基因和它的应用。更特别地,本发明涉及对感染显现出易感性的标记基因。
已知在本领域使用标记基因诊断对某种疾病的易感性是可能的。例如,致癌基因或肿瘤抑制基因被广泛地认为是对某种癌症易感性的标志,特别是考虑到突变的致癌基因和删除的肿瘤抑制基因与某种癌症之间的联系。另外,可用来预测较高风险发生癌症(例如乳腺癌)的基因例如BRCA基因已经被鉴定出来。还知道某些个体对感染特别是病毒感染有高的敏感性或抗性。预测疾病的易感性对那些拥有易感性基因的人避免和已知的病原学因子(aetiologicalagents)、化学药品或病毒不必要的接触并且采取已知的和正在开发的预防性的措施是有益的。这对设计抗病毒性疾病的疫苗和基因治疗也是有用的。
此外,发展抗主要病毒性疾病,例如抗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的有效疫苗是一个具有全球性社会经济后果的紧迫问题。HIV是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致病因子。开发这样的疫苗的一个关键是弄清楚针对HIV感染的天然抗性机制。已知几个宿主基因与可能的针对HIV感染的抗性以及在血清转化[1]后延迟或者加速AIDS进程相关。这些宿主基因包括编码趋化因子受体和细胞因子、充当天然杀伤细胞受体配体的杀伤免疫球蛋白类受体
(KIRs)和那些属于主要的组织相容性复合物(MHC)[1-11]的基因。
作为天然抗HIV感染的例子,已经知道有一些个体尽管持续地暴露于HIV也不会变成HIV阳性。一些天然抗性的个体拥有称作CCRΔ32的突变的HIV共同受体(co-receptor)基因[1-5]。然而,这个突变是隐性的并且通过阻止HIV进入细胞而赋予抗性的纯合体是非常罕见的。于是,上述突变不能解释显示自发的针对HIV感染具有抗性的大多数个体。在已存在的显示针对HIV感染具有天然抗性的人群中,存在多次和反复暴露于HIV但仍然不具有针对HIV起反应的血清IgG抗体的被称为HIV暴露血清阴性(ESNs)或HIV-1暴露但未感染个体(EUIs)的独特人群[12,13]。对来自这些ESNs/EUIs的尿道内或***分泌物中的HIV抗原特异性T淋巴细胞反应和HIV反应性IgA抗体的检测显示,他们已暴露于HIV但这种暴露仍没有造成感染[10-17]。将这种ESN/EUI状况与以前报导的遗传多样性联系起来的努力讫今仍未获成功。
此外,当考虑对HIV感染发展预防性和治疗性手段时,在一些HIV-1感染个体中缺少临床进展以及在一些明显抗性的人群中(尽管多次和反复地暴露于这种病毒)缺少可检测的HIV-1基因组是两个值得注意的现象[18-20]。在表型上,有一些尽管在外周血单核细胞(PBMCs)中缺少可检测的血浆
HIV-1RNA和HIV-1cDNA但显示有强HIV-1抗原特异性T细胞反应和HIV-1反应性粘膜IgA产物的个体[21-23]。他们通常被称作HIV-1暴露但未感染个体(EUIs)。由此类EUIs中分离的粘膜IgA产生的HIV-1中和活性的证据暗示HIV-1中和抗体的快速产生和类型转换可能赋予假定的抗HIV-1感染的免疫抗性。通过在非人类灵长类[27-30]中的被动转移和疫苗诱导的活性免疫实验已经证明了抗HIV-1相关猿免疫缺陷病毒(SIV)或致病嵌合体(HIV和SIV间的)的中和抗体的保护作用。然而,目前还不知道影响可能的保护性粘膜抗HIV-1抗体有效产生的遗传因子。
然而,在他们的同意下,通过研究从这些个体获得的DNA样品,本发明者已经发现ESNs在第22号染体上的某区域内微卫星座位上拥有独特稀有的等位基因,所述区域与小鼠第15号染色体上包含逆转录病毒抗性基因Rfv-3的染色体区域同线(syntenic)。于是,本发明者已鉴定了似乎与HIV感染抗性相关的特殊基因型或多态性。这第一次证明了被称为ESN或EUI状态的抗HIV感染的天然获得的免疫抗性可能受遗传影响。
因此,本发明者已鉴定了对感染特别是病毒感染和更特别是HIV感染具有易感性指示的标记基因和它的多态物(polymorphism)。
因而,本发明提供了一个确定对感染的易感性的方法,所述方法包括从受试者获取
DNA携带样品,并且分析样品以鉴定微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272中至少一个座位上存在的等位基因,其中存在于微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272上的特定等位基因是对感染具有抗性的指示。
本发明也包含了与这些座位互补的核酸(包括互补RNA)以及由其编码的氨基酸序列,和其同源物、拼接变体或功能等同物。
优选地,该方法用来确定个体对病毒感染的易感性。优选地对病毒感染的易感性是指对逆转录病毒这类的病毒,例如致癌病毒(oncovirus)、慢病毒或泡沫病毒(spumavirus)。HTLV和BLV(牛白血病病毒)是引起白血病的致癌病毒的例子。HIV和SIV是引起炎症和消瘦疾病的慢病毒的例子。人类泡沫病毒是泡沫病毒的例子。最优选的是确定HIV感染的易感性。
逆转录病毒可能是一种内源逆转录病毒,那就是在细胞内对某种生理刺激作出反应时产生的病毒。内源性病毒不会通过感染传播但能遗传。例如,由一个HIV阳性母亲生出的孩子通常是HIV阳性,尽管在出生后会发生血清转化,特别是如果婴儿不由母乳喂养。
于是,术语“感染”,如此处使用的,倾向于包括内源逆转录病毒和它们的行为以及传统意义上通过暴露于感染因子引发的感染。人类内源逆转录病毒
(HERV)是内源逆转录病毒的例子。
可以侵入性地或非侵入性地获得样品。优选的样品包括血、尿、精液、口腔拭抹物(mouthswabs)、皮肤细胞、剪下的指甲、毛发或子宫颈涂抹样品(cervicalsmearsamples)。
优选地,从样品中分离的DNA通过使用核酸扩增技术例如PCR或滚环复制或其他传统的核酸扩增技术进行扩增。在本发明中任何核酸扩增技术可能被同等地使用,并且无意将本发明限制在以上描述的方法中。
因而,本发明也提供了方法,其中通过使用DN***段长度分析、DNA杂交技术、DNA序列鉴定、单链长度多态性分析(SSLP)或参考链构象分析(referencestrandconformation,RSC)检测样品以确定特定基因型在微卫星座位存在或缺少。
更特别地,本发明提供了使用单链长度多态性(SSLP)分析的检测方法,并且用于PCR扩增微卫星标记的侧翼引物组选自D22S277左,TTCTTGTGTGGTAGTCTGGG;(SEQIDNo1)D22S277右,TACCNACTCCCCAAACTATG;(SEQIDNo2)D22S272左,GAGTTTTGTTTGCCTGGCAC;(SEQIDNo3)D22S272右,AATGCACGACCCACCTAAAG;(SEQIDNo4)D22S276左,CATTCTGCCAAGCAATTTAT;(SEQIDNo5)D22S276右,GCTGCTCTTTAAGTTTCTTGACC;(SEQIDNo6)D22S929左,GGAGCTGCATGTACTAGCTGG;(SEQIDNo7)D22S929
右,GCATTTATGGAGTATCCACAG;(SEQIDNo8)D22S1169左,GCACACACATGCACATAATC;(SEQIDNo9)和D22S1169右,AACAACTTCCAGCAGACG.(SEQIDNo10),其互补核酸或片段、多态物、拼接变体或同源物。
优选使用本领域熟知的DN***段长度分析,DNA杂交技术、DNA序列鉴定、单链长度多态性分析(SSLP)或参考链构象分析(RSC)检测样品中特定基因型是否存在于所述的微卫星座位。
下面的例子给出用于扩增微卫星标记的侧翼引物组的序列。这些序列的片段、多态物或同源物也都包括在本发明的范围内。
第二个方面,本发明也提供了一个用于诊断对感染的易感性的试剂盒,所述试剂盒包含用于确定微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272中至少一个座位上的基因型的试剂。
在优选的实施方案中,该试剂是用于扩增SSLP标记的PCR引物。诊断试剂盒可用来将人分成各种遗传群体,在这些群体中进行对感染的预防性和治疗性手段效果的比较和估计。因此,可以避免对拥有天然抗性的人使用不必要的治疗方法,并且减少治疗药物的剂量,而预防性手段和疫苗的使用可以集中在那些具有极度敏感性的人身上,可以期望在他们身上作出的努力会更成功。
因而,本发明也包括使用微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272中至少一个座位以确定对病毒疾病特别是逆转录病毒疾病和更特别地是HIV感染的易感性。也可以使用座位组合。
要注意的是,特定等位基因的存在表示具有对感染的抗性,并且因此在发明中该特定等位基因的缺少表示对感染的敏感性或易感性。在本发明最优选的实施方案中,被考虑的感染是AIDS的致病因子即HIV病毒。在这个方面,本发明提供了判断个体是否对HIV感染有抗性或是否对它敏感并因此有很高的风险传染上(contracting)这种疾病的方法。
于是,本发明也提供了判断对感染的抗性的方法,所述方法包括步骤从受试者获得DNA携带样品,并分析样品以确定存在于微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S423&D22S418或D22S272中至少一个座位上的等位基因,其中存在于微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S423&D22S418或D22S272上的特定等位基因表示对感染的抗性。
在另一方面本发明提供了一个对HIV感染易感性的诊断方法,所述方法包括对DNA样品中是否存在微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272中的一个、多个或每一个进行检测。
更进一方面,本发明还提供了基因治疗之类的治疗方法通过利用携带包含微卫星座位
D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272中至少一个座位的染色体片段的载体治疗对感染有易感性的受试者。如下所描述,影响与病毒感染抗性有关的免疫细胞功能的基因很可能位于与上述微卫星座位相邻的人类染色体片段上。不希望被理论束缚,这个基因(假定被称为小鼠Rfv-3的人类同源物)将感染抗性赋予了受感染个体,并且因此在处理、预防或治疗感染方面使用这个基因、它的转录物、表达的肽、多肽或蛋白、所述蛋白的糖基化、磺化、乙酰化或其它翻译后衍生物、功能衍生物、等同物或片段是本发明的另一方面。
微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272都编码肽、多肽或蛋白质片段。这些肽、多肽或蛋白质片段和它们的二级或三级衍生物都与病毒抗性相关,并且将它们应用于已被证实对病毒感染有易感性的人对防止或预防感染可能是有益的。
此外,糖基化物、磺化物、磷酸化物、乙酰化物或其它添加或替换产物、同源物、拼接变体、转录变体或由所述微卫星座位上的核酸序列衍生而来的产物可以用作此目的,并且因此被认为是本发明的组成部分。
因此,本发明也提供了包含一个或多个微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418
或D22S272编码的肽、多肽或蛋白片段的组合物。本发明也提供了用于治疗或预防感染的包含由一个或多个微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272编码的肽、多肽或蛋白片段的药物组合物。
所述组合物可以是杀微生物剂、药物组合物或饮食增补剂或食物添加物。药物组合物可以包括通常在制剂化学领域熟知的添加剂例如载体、溶剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、抗结块剂、防腐剂、缓冲剂、稳定剂或保湿剂。制剂可以以片剂、乳液、乳膏、悬浮液、可注射悬浮液、糖浆、栓剂、***栓剂、贴剂、浸渍植入物(impregnatedimplant)或其他传统递送方法的形式存在。
当组合物是杀微生物剂时,优选地以粘膜可施用的制剂形式提供组合物,用于例如口、鼻、直肠或***施用。用于直肠或***时,杀微生物剂组合物可以是凝胶、乳膏、栓剂、***栓剂的形式或其它用于直肠或***的传统方式。
杀微生物剂还可以用于抗病毒疾病的粘膜疫苗接种,特别是当本发明组合物以例如引起免疫学反应的方式使用时。
理想情况下,当预防的病毒感染是通过性接触传递的HIV时,组合物可以和避孕物结合。在这种情况下,避孕物可以是隔膜(diaphragm)、宫颈帽(cervicalcap)、避孕套、海绵或其它***内用具或屏障设施、包被的IUD用具、口服避孕药丸、避孕植入物或注射物或杀精子的凝胶、***栓剂
(pessary)、泡沫、膜剂或乳膏。
因此,本发明更进一方面提供了进一步包含由一个或多个微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272编码的肽、多肽或蛋白质片段的避孕物。
本发明的避孕物也可以进一步包含二级或三级衍生物、糖基化物、磺化物、磷酸化物或其它添加或取代产物、同源物、转录变体或由微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272的核酸序列衍生的产物。
在更进一步方面,本发明还提供了微卫星座位D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272编码的肽、多肽或蛋白质片段在制备治疗感染的药物中的用途。
此外,本发明扩大到二级或三级衍生物、糖基化物、磺化物、磷酸化物或其它添加或取代产物、同源物、转录变体或由D22S929,D22S277,D22S264,D22S1166,D22S423,D22S1169,D22S418或D22S272微卫星座位上的核酸序列衍生而来的产物在制备用于治疗感染的药物中的用途。
优选地,所述感染是病毒感染并且更优选地是逆转录病毒感染。在最优选的实施方案中,所述病毒是HIV或HTLV病毒。