微生物检测方法及试剂盒的制作方法.docx

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专利名称:微生物检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域:
本发明涉及食品和生物样品中含有的微生物、工业用水和自来水等环境中含有的微生物的检测方法、以及微生物检测试剂盒。进一步详细来说,本发明涉及能够选择性地检测食品和生物样品、工业用水和自来水等环境中含有的微生物的活菌(生菌)的检测方法、以及微生物检测试剂盒。
背景技术:
以前采用平板培养法测定食品、生物样品、或者环境中的总活菌数。但平板培养法需要两天左右的时间才能得到结果。
由于食品灭菌技术和加工技术的提高,对鉴别即使微量存在于被测样品中的微生物的生死状态的需求也正在提高。特别是在食品卫生
检查和临床检查领域中,作为细菌的迅速检测方法,尝试了通过PCR法将各细菌的特异基因扩增至视觉上可观察到的量,以鉴别各细菌是否存在以及对其进行定量。但是,当以细菌的DNA为耙标(target)时,被测样品中原来含有的死菌的背景(background)也被检测到,因此,用PCR法得到阳性结果时,并不一定表明存在活菌。因此,在食品卫生、临床检查领域,存在虽然PCR灵敏度高且迅速但并未广泛应用的现状。
最近,正在尝试以mRNA为靼标,通过逆转录酶制备cDNA后,使用各细菌的特异引物进行PCR,仅对被测样品中的活菌进行检测和定量的方法。但是,这种方法并不能抑制死菌本身的mRNA的逆转录,并且当被测样品中含有10、fu/ml或104cfu/g以上的死菌时,会导致检测到死菌的背景,因此也不能说该方法是充分地判定存活与死亡的方法。
具体而言,专利文献1和专利文献2记栽的方法中公开了利用PCR法鉴别细菌等微生物存活与死亡的方法。然而,这些利用PCR法鉴别细菌等微生物存活与死亡的方法存在如下所述问题。
上述专利文献l的技术列举了在进行100。C、10~30分钟高温长时间加热灭菌的一部分煮沸(boil)食品中对死菌的鉴别、以及在进行乙醇灭菌或甲醛灭菌的食品中对微生物的鉴别,但尤其是对于后者,实
际上不存在进行那样灭菌处理的食品。此外,未设想以下检测在实施了现在食品工业上作为主流灭菌方法的低温保持灭菌(LTLT灭菌)、高温短时间灭菌(HTST灭菌)或者超高温瞬间加热灭菌(UHT灭菌)的食品中仅对存活微生物的检测;在接受抗生素治疗的感染症患者中的临床样本中仅对存活的特定病原菌等的检测。另外,专利文献1的技术中,当被测样品中死菌背景以10、fu/ml以上的浓度存在于食品或临床样本时,则来自死菌的PCR最终扩增产物量超出检测限,导致无法鉴
别被测样品的PCR阳性反应是来自活菌还是来自死菌。
此外,上述专利文献2的技术公开了鉴别活菌和死菌的方法,该方法利用了死细胞的RNA/DNA摩尔比与活细胞的RNA/DNA摩尔比相比相对降低。该方法为提取总RNA(totalRNA),利用逆转录反应来制备互补DNA后,进行PCR并算出其Ct值,根据另外制作的标准曲线求出RNA的摩尔浓度,另一方面,通过PCR扩增与该RNA相应的染色体DNA区域并求出Ct值,再通过上述标准曲线算出染色体DNA的摩尔浓度,由此求算RNA/DNA的摩尔比。也就是说,上述操作必须进行繁杂的总RNA提取,并且需要逆转录反应-PCR两个步骤,因此,在定量性和迅速性方面,劣于通常的以DNA为靶标的PCR。并且,活菌中不断产生RNA,而来自死菌的RNA在早期被分解,因此稳定性欠佳。另外,含有高浓度死菌的食品、临床样本中只能检测到其1/10浓度的活菌。因此,很难用于要求迅速、高灵敏度及精确度的食品卫生检查和临床检查。
专利文献1:日本特表2003-530118号^S报
专利文献2:国际公开第2002/052034号公报
发明内容
本发明的课题在于提供与死菌(Deadcell)或损伤菌(损伤菌(Injuredcell)或者活而非可培养菌(Viable-but國NonCulturablecell);"VNCcell
,,)相比,选择性地检测食品或生物样品中含有的微生物的活菌(Livecell)(活且可培养菌(Viable-and-Culturablecell))的方法,即,提供直接保留了培养法特性的迅速替代检测方法、以及用于实施该方法的试剂盒。本发明人对能适用于各种灭菌方法的、适合检测灵敏度高的食品卫生检查的微生物存活死亡的鉴别法、以及能够检测医院活临床现场中感染症患者的特定病原菌的方法进行了深入研究,结果发现,在鉴别被测样品中微生物的活菌和损伤菌的方法中,用交联剂(该交联剂是,
通过350nm700nm波长的光照射可使DNA交联的交联剂)处理被测样品,再用具有350nm700nm波长的光对所述样品进行照射,除去上述交联剂后,添加适合培养被测样品中所含的微生物的培养基并保温一定时间,再次用上述交联剂进行处理,并用具有350nm700nm波长的光进行照射,然后利用核酸扩增反应来选择性扩增微生物中的染色体DNA,从而可以迅速地进行上述鉴别,进而完成了本发明。
即,本发明提供用于检测被测样品中微生物的活菌的方法,该方法包括以下工序。
a)向上述被测样品中添加交联剂的工序,该交联剂利用350nm700nm波长的光照射使DNA交联;
b)对添加了交联剂的被测样品进行350nm700nm波长的光照射处理的工序;
c)除去经光照射处理的被测样品中所含的交联剂的工序;
d)向除去了交联剂的被测样品中添加培养基并保温的工序;
e)向经保温的被测样品中再次添加交联剂的工序,该交联剂利用350nm700nm波长的光照射使DNA交联;
f)对添加了交联剂的被测样品进行350nm700nm波长的光照射处理的工序;
g)从上述被测样品中提取DNA,用核酸扩增法来扩增所提取的DNA的乾区域(targetregion)的工序;以及
h)解析扩增产物的工序。
上述方法优选的实施方式是,用微生物的标准样品制成表示微生物量与扩增产物之间关系的标准曲线,使用该标准曲线对上述扩增产物进行解析。
另外,上述方法优选的实施方式是,上述核酸扩增法为PCR法、LAMP法、SDA法、LCR法或者DNA微阵列法。
另外,上述方法优选的实施方式是,釆用实时PCR法进行上述PCR,并且PCR与扩增产物的解析同时进行。另外,上述方法优选的实施方式是,上述,皮测样品为食品、血液
样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品、胸水(pleuraleffusion)样品、工业用水、自来水、地下水、河水或雨水中的任一种。
另外,上述方法优选的实施方式是,上述交联剂选自单叠氮乙啡啶(ethidiummonoazide)、双叠氮乙啡咬(ethidiumdiazide)
、补骨脂素(7乂,一py)、4,5,,8-三曱基补骨脂素、以及8-甲氧基补骨脂素。
另外,上述方法优选的实施方式是,上述靼区域是50~5000个碱基的区域。
另外,上述方法优选的实施方式是,上述微生物是病原菌(pathogenicbacterium)。在该实施方式中,上述乾区域优选为病原基因(pathogenicgene)。
此外,本发明提供用于利用核酸扩增法来检测被测样品中微生物的活菌的试剂盒,该试剂盒包括以下组分
利用350nm700nm波长的光照射使DNA交联的交联剂、培养基、以及用于利用核酸扩增法来扩增检测对象的微生物DNA靶区域的引物。
上述试剂盒优选的实施方式是,上述核酸扩增法为PCR法、LAMP法、SDA法、LCR法或者DNA微阵列法。
另外,上述试剂盒优选的实施方式是,上述交联剂选自单叠氮乙啡啶、双叠氮乙啡啶、补骨脂素、4,5,,8-三***补骨脂素、以及8-甲氧基补骨脂素。
表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的李斯特菌(Zis^7'a)(活菌和损伤菌)的hylA-PCR最终扩增产物谱带(band)强度的电泳图像。活李斯特菌活菌;损李斯特菌损伤菌表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的阪崎肠杆菌(活菌和损伤菌)的MMS-PCR最终扩增产物镨带强度的电泳图像。活
阪崎肠杆菌活菌;损阪崎肠杆菌损伤菌[图4]表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的沙门氏菌(5"/附0船//)(活菌和损伤菌)的invA-PCR最终扩增产物谱带强度的电泳图像。活沙门氏菌活菌;损沙门氏菌损伤菌表示经过交联剂(EMA)单次处理和多步处理的沙门氏菌(活菌和损伤菌)的肠***-PCR(enterotoxin-PCR)最终扩增产物谱带强度的电泳图像。活沙门氏菌活菌;损沙门氏菌损伤菌
具体实施例方式
接着,对本发明优选的实施方式进行详细说明。但本发明不限于以下的优选实施方式,可以在本发明的范围内进行自由变更。另外,本说明书中的百分率如没有特别说明则表示质量百分率。
本发明的方法中,作为检测对象,只要最终能够扩增,则可以是所有核酸,具体可以列举单链DNA、双链DNA、单链RNA和双链RNA,其中,优选将DNA作为检测对象,特别优选双链DNA。
本发明的方法
技术领域:
本发明的方法是用于检测;故测样品中微生物活菌的方法,该方法包括以下工序。
a)向上述被测样品中添加交联剂的工序,该交联剂利用350nm700nm波长的光照射使DNA交联;
b)对添加了交联剂的被测样品进行350nm700nm波长的光照射处理的工序;
c)除去经光照射处理的被测样品中所含的交联剂的工序;
d)向除去了交联剂的被测样品中添加培养基并保温的工序;
e)向经保温的被测样品中再次添加交联剂的工序,该交联剂利用350nm700nm波长的光照射使DNA交联;
f)对添加了交联剂的被测样品进行350nm700nm波长的光照射处理的工序;
g)从上述被测样品中提取DNA,用核酸扩增法来扩增所提取的DNA的乾区域的工序;以及
h)解析扩增产物的工序。
本说明书中的"被测样品,,是指,对其中存在的微生物活菌进行检测的对象,只要通过由核酸扩增法对染色体DNA的特定区域的扩增能
8够检测微生物的存在,则对被测样品没有特殊限制,可列举食品、血液样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品、胸水样品、工业用水、自来水、地下水、河水或雨水等。作为食品,优选清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料等饮料(包括这些饮料的浓缩原液及配制用粉末);冰淇淋、冰果子露(icesherbet)、刨冰等冰制食品;加工乳、乳饮料、发酵乳、黄油等乳制品;经肠营养食品、流体食物、婴幼儿奶、运动饮料;特定保健用食品、健康辅助食品等功能性食品
等。本发明中,被测样品可以是上述产品或生物样品本身,也可以是其稀释品或浓缩品,或者是经过本发明处理方法以外的前处理的样品。上述前处理可以列举加热处理、过滤、离心分离等。
并且,可以通过酶处理等来除去或减少被测样品中存在的微生物以外的细胞、蛋白质胶体粒子、以及脂肪等杂质。作为上述被测样品中存在的微生物以外的细胞,当被测样品是乳、乳制品、以乳或乳制品为原料的食品时,可以列举牛白细胞和乳腺上皮细胞(mammaryepitheliocytes)等。此外,当被测样品是血液样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品或胸水样品等生物样品时,上述被测样品中存在的微生物以外的细胞可以列举红细胞、白细胞(粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等)以及血小板等。
作为上述酶,只要可以分解上述杂质并且不损伤检测对象微生物的活菌,则没有特殊限制,例如可以列举脂质分解酶和蛋白分解酶。上述酶可以单独使用一种,也可以两种以上并用,但优选同时使用脂质分解酶和蛋白分解酶。
作为脂质分解酶,可列举脂肪酶、磷酸酶等;作为蛋白分解酶可列举蛋白酶K、链霉蛋白酶等。
"微生物,,是本发明的方法所检测的对象,只要能利用核酸扩增法进行检测,并且交联剂对微生物的活菌与对死菌、损伤菌的作用不同,则没有特殊限制,优选细菌、真菌、酵母等。作为细菌,包括革兰氏
阳性菌和革兰氏阴性菌两者。作为革兰氏阳性菌,可列举表皮葡萄球菌Cftflp/^/ococcMs印iV/er附/rfzX)等葡萄球菌属细菌;链球菌属细菌;单核增生李斯特菌(ZiWenVi附omc3^gewe力等李斯特属细菌;蜡状芽孢杆菌(5fl"7/^cw^w)等芽孢杆菌属细菌;分枝杆菌属细菌;肉毒梭菌(C7o^nVZ/m挑6o似/i7im附)、产气荚膜梭菌(C7oWnVZ/"/w/7^/h'"^e/w)等梭菌属细菌等。此外,作为革兰氏阴性菌,可列举大肠杆菌(五sc/^n'c/i/fl/0等大肠杆菌属细菌;阪崎肠杆菌(五w&w6a"wsfl^zfl&7)等肠杆菌属细菌;柯氏柠檬酸杆菌(C,7n^fl"er^wn')等柠檬酸杆菌属细菌;产酸克雷伯菌(K/WwW/fl欣j;似aO等克雷伯菌属细菌为代表的肠内细菌群;沙门氏菌属细菌、弧菌属细菌、假单胞菌属细菌等。
本发明中的"活菌"(livecell)是指,在通常的优选培养条件下培养时能够增殖、且为显示该微生物所具有的代谢活性的状态(活且可培养状态,Viable-and-Culturablestate),并且是几乎没有细胞壁损伤的微生物。另外,这里所说的代谢活性可以列举ATP活性、酯酶活性。
"死菌"(deadcell)是指,即使在优选的培养条件下培养时也不可能增殖、为不显示代谢活性状态(Dead)的微生物。并且是虽然维持细胞壁的结构,但细胞壁自身已高度受损,碘化丙锭(propidiiimiodide)之类的弱透过性的核染剂等可透过细胞壁的状态的微生物。