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专利名称:微生物异构化α-羟基羧酸的方法
技术领域:
本发明涉及使用α-羟基羧酸外消旋酶微生物异构化α-羟基羧酸的方法、用于该方法的酶和表达适当的外消旋酶活性的微生物、具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的微生物的筛选方法、编码该酶的核酸序列、表达载体、表达该外消旋酶的重组微生物,和产生或分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法。
背景技术:
现有技术公知被称作微生物扁桃酸外消旋酶的酶,其能够在体外和体内外消旋扁桃酸(,,,″MandelateRacemaseStructure-FunctionStudiesofaPseudosymmetricEnzyme″,.,28,178-186(1995);,,,″RacemizationofVinylglycolateCatalyzedbyMandelateRacemase″,.,60,3347-3351(1995);,,,,,″MechanismoftheReactionCatalyzedbyMandelateRacemaseTheStructureandMechanisticPropertiesoftheD270NMut
ant″,Biochemistry,35,5662-5669(1996))。
同时,制药工业上非常需要能够简单生产手性、非外消旋物质,例如活性成分的生产。酶催化的化合物立体异构形式的外消旋化导致所需的对映异构体,这将构成产生所需的手性、非外消旋物质的适宜途径。然而,目前公知的外消旋酶具有高底物特异性的特征。因此,扁桃酸外消旋酶仅适于β、γ-不饱和的α-羟酸的生物催化外消旋。不能接受饱和的α-羟基羧酸(参考Felfer,,,213(2001))。
发明概述因此,需要与已知的外消旋酶相比具有不同或更宽底物范围的外消旋酶活性的酶。
本发明的目的是提供具有新的外消旋酶活性的微生物和酶制品,以及使用这些酶或者微生物外消旋化立体异构化合物的方法。
令人惊奇的是,我们发现使用具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶的通过α-羟基羧酸微生物异构化方法已经实现了此目的。
本发明的一个方面涉及微生物异构化式I的α-羟基羧酸的方法其中R为直链和分支的低级烷基和低级链烯基,优选C2-C8烷基,或者-(CH2)n-Cyc,其中n为0到4的整数,优选1、2或3,Cyc是未取代的或者单或多取代的、单或二核碳环或杂环,例如未取代或取代的芳环或者杂芳环,优选未取代或者取代的单核芳环,其中借助具有
α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶异构化含有基本上为式(I)α-羟基羧酸的第一种立体异构形式((R)或(S))的底物,并且合适的话,分离得到的异构体混合物((R)/(S))或者得到的第二种立体异构体((R)或(S)型),或者从反应平衡取走得到的第二种立体异构体。
优选通过将底物与纯化的酶反应,例如与具有基于蛋白质纯度大于50%(如>80%或>90%或90到99%)的酶反应,还可以与含有酶的细胞提取物(如细胞破裂和除去细胞残渣后的粗提物)反应或者在表达具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的至少一种酶的完整细胞存在下反应,来实施酶促异构化。
可以优选从形成或者代谢乳酸的微生物(例如乳酸细菌或者丙酸细菌)分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶。尤其适当的来源是乳杆菌属(lactobacillus)和乳球菌属(lactococcus)的细菌。
根据优选的变通方案,在表达本发明的α-羟基羧酸外消旋酶活性的乳杆菌属微生物的完整细胞或者重组微生物的完整细胞存在下进行反应。
优选的微生物选自副干酪乳杆菌()、德氏乳杆菌()、,尤其是副干酪乳杆菌DSM20207和DSM2649,德氏乳杆菌DSM20074,
。
在进一步优选的方法变通方案中,酶为具有更宽的底物范围的乳酸外消旋酶(),即除了(R)-或(S)-乳酸之外还外消旋上述式I的至少一种其他(R)-和(S)-α-羟基羧酸的酶。
可以根据本发明而使用的酶活性包括例如外消旋化选自苯基乳酸、4-***苯基乳酸、2-羟基-4-苯基丁酸、2-羟基-4-***戊烷羧酸和2-羟基-3-***丁酸的(R)和/或(S)形式的至少一种的酶活性。
在上述方法的优选实施方案中,通过例如,层析、随后的化学或者酶立体选择性反应基本上取出了所需的立体异构体,适当的话,从形成的异构体混合物进一步分离下游产物,优选从反应介质分离(例如层析分离)混合物后进行,并再次异构化含有基本上是不需要的立体异构体的残余物。这可以重复任意次数,直到完全转化成所需的立体异构体或者得到所需的其下游产物。
在上述方法的另一优选变通方案中,形成的异构体混合物经受随后的化学或者酶立体选择反应,优选从反应介质分离(例如层析分离)混合物后进行,并且根据本发明再一次异构化所得还含有未反应的羟基羧酸异构体的反应混合物。这可以重复任意次数,直到完全转化成所需的立体异构体或者得到所需的其下游产物。
在上述方法的另一优选变通方案中,将异构化反应与随后的化学或者酶对映选择反应耦联,优选在称作“单罐反应”中耦联,其中从反应平衡逐步或者连续取出产生的所需α-羟基羧酸立体异构体。
优选的本发明的异构化步骤后的化学或酶对映选择反应选自α-羟基羧酸立体异构形式的酯化和酰***化。尤其可以在羧基或者羟基上进行随后的对映选择反应。
本发明的另一方面涉及筛选表达具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶的微生物的方法,其中在含有基本上为上述式Iα-羟基羧酸的立体异构形式的底物存在下培养猜测具有外消旋酶活性的微生物,并检查反应介质中底物的外消旋化(例如,一种立体异构形式的量的减小和/或另一种立体异构形式的量的增加)。
根据本发明的筛选方法不限于特定微生物。原则上,可以用所有已知的真核和原核微生物、动物细胞或者植物细胞进行本发明筛选方法。然而,优选形成或者代谢乳酸的那些微生物,例如乳酸细菌或者丙酸细菌。尤其适当的来源是乳杆菌属细菌。
优选筛选的微生物是将基本上的立体异构底物外消旋1到100%,优选20到100%,特别是50到100%或者80到100%(外消旋(%)=2R/(R+S)×100;R=R形式的浓度;S=S形式的浓度)。适当的转化率为1到50%,优选5到50%,特别是
15到50%或者30到50%(转化率(%)=R/(R+S)×100)。
本发明的另一方面涉及外消旋/异构化上述式I的至少一种化合物的α-羟基羧酸外消旋酶。可以通过培养已经在上述定义的筛选方法中经测试对外消旋酶活性呈阳性的微生物并从培养基分离α-羟基羧酸外消旋酶而得到所述α-羟基羧酸外消旋酶。
特别优选的α-羟基羧酸外消旋酶是将上述式I的α-羟基羧酸外消旋1到100%,优选20到100%,特别是50到100%的α-羟基羧酸外消旋酶。
本发明的另一方面涉及编码至少一种上文定义的α-羟基羧酸外消旋酶的核酸序列。
本发明还涉及表达载体,其包含与至少一个调节核酸序列有效连接的至少一个编码α-羟基羧酸外消旋酶的核酸序列。
本发明还涉及重组原核或者真核微生物,其含有至少一种上文定义的核酸序列或者至少一种上文定义的表达载体。
本发明的另一方面涉及产生具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法,其中培养表达具有所需外消旋酶活性的酶的如上定义的重组微生物并从培养物分离所述蛋白质。
最后,本发明涉及分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法,其中破碎经过测试对外消旋酶活性层阳性的上文定义的非重组微生物(尤其乳杆菌属微生物),去除细胞壁碎片
并分离具有所需的酶活性的蛋白质。
,则应用下面的一般情况“外消旋物”表示光学活性化合物的两种对映异构体的等摩尔混合物。
根据本发明,“外消旋化”或“异构化”发生在羟基羧酸的α-碳原子。
“卤素”为***、***、溴或碘,特别是***或***。
“低级烷基”优选为具有2到8(特别是2到6)个碳原子的直链或者分支烷基,如乙基、异丙基或正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或2-***丁基、正己基、2-***戊基、3-***戊基、2-乙基丁基。
“低级链烯基”为具有2到8(特别是2到6)个碳原子的上述烷基的单或多不饱和(优选单不饱和)类似物,双键可以在碳链的任何位置。
“芳基”为通过任意环位置结合的单核或二核、未取代或取代的芳香基团,特别是苯基或萘基,如1-或2-萘基。适当的话,这些芳基可附着1个或2个相同或不同的取代基,所述取代基选自上文定义的卤素、低级烷基、低级烷氧基或者三******。
-羟基羧酸根据本发明,可通过外消旋化转化的α-羟基羧酸为上述式(I)的α-羟基羧酸,其中R为直链或分支的低级烷基或者低级链烯基或者-(CH2)n-Cyc
,其中n为0到4的整数,Cyc为未取代或单或多取代的、单或二核碳环或杂环。这些化合物可以根据本发明以对映异构纯的形式(即作为R或S对映异构体)或者作为两种对映异构体的非外消旋混合物外消旋化。
用于酶促合成的式Iα-羟基羧酸为本身已知并且可以使用有机合成中公知的一般方法得到的化合物。
必须提及的碳环和杂环基团Cyc的实例具体为单或二核(优选单核)基团,其具有最多4个,如0、1或2个相同或不同的选自O、N和S的杂原子。
这些碳环或杂环具体包括3到12(优选4、5或6个)环碳原子。可以提及的实例为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、它们的单或多不饱和类似物,如环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环庚二烯基和苯基;和具有1到4个选自O、N和S的杂原子的5到7元饱和或单或多不饱和杂环基。必须特别提及的是衍生自吡咯烷、四氢呋喃、哌啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、噁唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、哒嗪和吡嗪的杂环基。
将提及的其它基团是上述碳环或杂环之一与其他杂环或者碳环稠合的二核基团,例如,衍生自苯并呋喃、吲哚、喹啉和萘的基团。
在该上下文中,基团Cyc可以通过任意环位置(优选通过环碳原子
)键合。
适当的Cyc基的实例为苯基、萘基、2-噻吩基、3-噻吩基;2-呋喃基、3-呋喃基;2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基;2-噻唑基、4-噻唑基或者5-噻唑基;4-***-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-***-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-***-3-噻吩基、3-***-2-噻吩基;3-***-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-***-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基和4-***-2-噻吩基。
基团Cys还可以是单取代或者多取代的,例如单取代或二取代的。优选地,取代基附着到环碳原子上。适当的取代基为卤素、低级烷基、低级链烯基、低级烷氧基、-OH、-SH、-NO2或者NR2R3,其中R2和R3相互独立地为H、***或乙基。优选的取代基为卤素。
Cyc基的另一优选基团为上文定义的芳基。
-羟基羧酸外消旋酶活性的酶尤其可以从乳杆菌属微生物获得具有根据本发明的α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶。
优选的酶可以分离自乳杆菌属的副干酪乳杆菌DSM20207(DSM15755)和DSM2649(DSM15751)、德氏乳杆菌DSM20074(DSM15754),(DSM15753)(DSM15752)株系。这些株系可以从DSM(德意志微生物保藏中心)获得。
使用常规制备级生物化学方法可以从细胞培养物中分离酶。然后,可以以常规方法(例如通过肽片段化和N-末端测序)可以从分离的酶推导出以以一级氨基酸序列信息。
本发明还包括可以从上述微生物分离的具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的天然酶的“功能等价物”。
就本发明而言,天然外消旋酶的“功能等价物”或者类似物为与天然外消旋酶不同但是保留所需的生物活性(例如底物特异性)的多肽。从而,例如,“功能等价物”理解为指这样的酶,其外消旋化选自苯基乳酸、4-***苯基乳酸、2-羟基-4-苯基丁酸、2-羟基-4-***戊烷羧酸和2-羟基-3-***丁酸的至少一种化合物并且具有来自上述乳杆菌属株系的天然外消旋酶活性的至少20%,优选至少50%,特别优选至少75%,非常优选至少90%,或者高于天然外消旋酶的活性的活性。此外,功能等价物优选在约pH4到10是稳定的并且有利地具有pH5到8的最适pH,和20℃到80℃的最适温度。
根据本发明,“功能等价物”尤其还理解为指突变体,其在天然氨基酸序列的至少一个序列位置上具有不是天然氨基酸的氨基酸并且仍然保留至少一种上述生物活性。从而,“功能等价物”包括通过一个或多个氨基酸加入、替代、缺失和/或倒位得到的突变体,上述修饰可以发生在任意序列位置,只要它们导致具有根据本发明的性质谱的突变体。具体地,当突变体和未修饰的多肽之间的反应性模式就质量而言一致