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专利名称:突变酶的制作方法
技术领域:
本发明涉及具有增强性能的突变酶。
背景技术:
生物酶催化剂,如P450bm_3酶,发现越来越多地用于从精细化学品、中间体、药品和药物代谢物的合成到有机化学污染物和污物的降解的各种工业应用中。蛋白质工程,采用定向进化(directedevolution)或定点突变,可以用于分离已知酶的变异体,这可以对它们的催化活性产生新的契机和应用。巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)(1)的P450BM_3属于细胞色素P450酶的超家族(或超族,superfamily)。在各种基因序列数据库中存在超过7,700个编码P450酶的基因。P450酶的命名法也已经系统化。酶的超家族称为CYP,之后是酶家族的编号(因此,为CYP1、CYP51、CYP102等),其被分成通过字母表示的子族(因此,为CYP1A、CYP101B等),并且每一子族成员由数字标识(因此,为CYPlAl、CYP3A4、CYP101D3等)。编码CYP酶的基因由斜体表示,例如CYP101A1基因。P450bm_3已被标识为CYP102A1,即,它是CYP102家族的第一成员。自此,CYP102A1的系统命名将用于P450bm_3。CYP102A1(1)是用于生物转化应用的受关注的酶,因为其是催化上自给自足的。与其他
P450酶不一样,其中P450单加氧酶和电子转移辅助因子蛋白是独立的部分(entities),CYP102A1具有融合至二弗拉芬(diflavin)电子转移还原酶域的血红素单加氧酶域,其在单个多肽中同时含有FAD和FMN辅基。CYP102A1的天然底物被认为是直链或支链的中链脂肪酸(1,2)。CYP102A1血红素域的晶体结构在1993年(3)就可获得,其中揭示了活性位点结构并且存在底物进入通道(或底物接近通道,substrateaccesschannel)0
四年之后公布的具有结合底物的晶体结构,指出对于F87—旦底物结合后侧链构象的变化⑷。对CYP102A1的蛋白质工程已经进行了综述(57)。早期的研究集中在活性位点残基F87,其中F87V、F87A、F87Y和F87G突变已经显示出对脂肪酸氧化的活性和选择性具有不同的影响(811)。F87上的突变已经发现有利于各种底物的氧化(7)。在底物进入通道入口处的残基如F42、R47和Y51也被标靶。虽然F42A突变降低了酶活性(10),但是中和或逆转在47位置处的电荷改变了底物的特异性(8,12),正如疏水性取代Y51A—样。W00031273公开了突变的R47L/Y51F偶联体(或结合体,couplet)用来促进疏水性有机分子如聚芳香烃和类萜烃的进入、结合和氧化。该偶联体也与F87A、I263A、A264G和M354A突变组合以提供增强的底物氧化的活性和/或产物选择性(13,14)。R47L/Y51F组合,以及在其自身上的R47L
和Y51F突变,现在通常用于CYP102A1工程(1519)。除了突变位点的合理选择之外,筛选技术已经用于识别对活性和选择性具有期望影响的其他突变和突变位点。随机或位点饱和诱变早在1997年就应用于CYP102A1(20)。N020020380公开了使用经由吲哚氧化生成靛蓝作为发现具有新的活性的CYP102A1突变的筛选方法。饱和诱变应用于许多可能影响底物结合的残基,而突变体A74G/F87V/L188Q据报道相比于野生型能以增强的活性和改变的选择性氧化很宽范围的有机分子(2125)。AT342351T公开了经由ω-对硝基苯氧基-羧酸氧化而采用光谱检测到对硝基苯酚的生成,在一组随机诱变实验中作为筛选程序。突变￥261\147、5726、4746、?874狄丄188Α,G,N,K,Q,R,S&W、M354T都已公开(26,27)。对硝基苯酚筛选方法通过采用对硝基苯氧基辛烷作为替代底物(surrogatesubstrate)而得以扩展。W02002083868、EP1470219和US2005202419()公开了突变L52I、I58V、F87A、H100R、S106R、F107L、A135S、M145A&V、A184V、N239H、S274T、L324I、V340M、I366V、K434E、E442K、V446I。W02003008563和US2003100744公开了采用相同方法的更多轮随机诱变、基因重组(geneshuffling)和筛选的结果,并报道了突变M30I、E64A、V78A、F87A,D,G,H,I,K,N,R,V&W、H138Y、F162S、
H171Q、T175I、V178I、A184V、N186D、D217V、I220T、K224I、S226I、D232G、T235A、H236Q、E252G、R255S、I258T、I259V、T268Q、A290V、A295T、L353V,D370Q,E380G、G396M、T411A、M416L。、L75I&W、V78A,F&T、A82L,F,G,I,S&T、F87I,L&V、T88C、K94I、P142S、T175I、A184V、F205C、S226R、H236Q,E252G、R255S、T260,L,N&S、A290V、A328V&M、L353V。随后,W02006105082公开了突变R47C、V78F、A82S、K94I、P141S、T175I、A184V、F205C、S226R、H236Q,E252G、R255S、A290V、A291V、A328F、L353V。这些通过随机诱变产生的系列突变体显示出对于从乙烷到中链烷烃的烷烃氧化的增强的活性(2830)。也存在选择性变化,尤其是在定向进化变异体与通过定点诱变引入到活性位点的突变组合时,例如,在辛烷氧化中,其中突变将氧化位点向末端碳转移(31),在末端烯烃的选择性环氧化中(32),以及对映选择性在环戊烷羧酸衍生物的氧化中(33)。值得注意的是,通过使定向进化与合理的重新设计进行组合经常可以获得更好的结^οCYP102A3是与CYP102A1属于相同子族(sub-family)的P450酶。CYP102A3的随机诱变,接着烷烃氧化并在对末端醇特异性的醇脱氢酶存在的情况下监控NADH的形成,产生了由辛烷氧化生成50%的1-辛醇的突变。这是迄今为止通过设计的
CYP102族P450酶所观察到的直链烷烃的末端C-H键氧化的最高比例(34)。仍继续需要分离工业上有用的酶如CYP102A1酶的另外的突变,以进一步理解结构变化对它们的催化机理的影响,改进它们的催化转化(catalyticturnover),并扩大其底物和/或产物的范围。通常,进行P450酶如CYP102A1的设计以增强酶活性,其中控制产物选择性和底物特异性是第二重要的目标。可将选择性控制结合至增强的单加氧酶活性的突变和突变位点是显著缺乏的,以致化合物的酶转化可以是较快的但是没有足够的选择性,或虽有一定的选择性但反应很慢,或期望的产物并未形成。对于可以提供具有增强的活性和/或期望的选择性的突变体的筛选方法也存在需要。
发明内容
现在已经发现,根据本发明,CYP102A1特异性位置的取代突变在增强单加氧酶活性方面具有期望的作用,并且也提供了改变的选择性。这些突变位点通过使用提供增强的活性和增强/改变的选择性选择的新型筛选方法来识别。本发明提供了一种突变CYP102A1酶,其具有增强的单加氧酶活性和/或改变的选择性,并含有在CYP102A1的位置117、131、191、215、276、307、330、377、401、403、425中的一个或多个处的取代。另外还提供了一种用于氧化作为有机化合物的底物的方法,该方法包括用本发明的突变CYP102A1酶来氧化所述有机化合物。所要求的取代
(替代,substitution)构成相同的本发明构思的一部分,因为它们共同具备增强单加氧酶活性的效应和/或改变CYP102A1的选择性。在位置330、401和403的取代也经由如下所概述的共同结构和功能机制发挥它们的作用。序列表中的序列SEQIDNO1是CYP102A1的序列。
图1相关残基在CYP102A1(P450BM_3)中的定位。Palm表示该酶的脂肪酸底物。图2在野生型CYP102A1和A330P突变体的底物进入通道中的关键残基和活性位点的比较,突出表明了由A330P突变产生的P329和A328处的结构摄动(structuralperturbations)。
具体实施例方式本发明可以适用于CYP102A1的天然和人工同源物(或同系物,homologues),例如,其包括与CYP102A1具有至少40%的氨基酸序列同一性的序列。这样的同源物典型地包括对应于(即与之具有同源性或相同于)CYP102A1的血红素单加氧酶域的氨基酸序列(由氨基酸位置1480表示)。本发明的酶包括与SEQIDNO:1(CYP102A1的序列)具有至少40%同一性的序列(或由其构成)。在优选的实施方式中,该序列在至少20,优选至少30,例如至少40、60、100、200、300、400或更多个邻近氨基酸内,或甚至在同源物的整个序列内与其可能具有至少55%、65%、80%或90%,并且更优选至少95%、97%或99%的同源性。在一个实施方
式中,本发明的酶在与CYP102A1的氨基酸残基1480相比时具有任何指定的百分比同源性。邻近氨基酸可以包括活性位点。该同源性可以可替换地并不在邻近氨基酸内而是仅仅在活性位点的氨基酸内进行测定。因此,同源性基于氨基酸的同一性典型地至少40%同源于CYP102A1。本发明的酶可以与CYP102A1序列具有一定百分比同一性,这与以上提及的任何序列长度内任何具体百分比同源性值(即,其可以具有至少40%、55%、80%或90%以及更优选至少95%、97%或99%的同一性)相同。同源序列可以表示CYP102A1序列的突变部分和/或可以以本发明酶的全长融合多肽的形式存在。本文中所提及的任何同源蛋白(即,描述为与另一蛋白同源)典型地至少40%同源于相关的蛋白。同源性可以采用已知的方法进行测定。例如,UWGCG软件包提供了可以用于计算同源性的BESTFIT程序(例如,以其缺省设置进行使用)(DeVereUXetal(1984)NucleicAcidsResearch12,387—395)。
PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或比对序列(典型地按照其缺省设置),.(1993)JMoIΕνο136:290_300;Altschul,S,Fetal(1990)JMoIBiol215:403-10中所描述的。用于进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(/)
公开获得。该算法首先涉及通过在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阈值评分T的查询序列中识别长度W的短字来识别高评分序列对(HSP)。T称为邻近字评分阈值(Altschuletal,supra)。这些初始的邻近字命中(wordhits)作为用于初始搜索以找到含有它们的HSP的种子(seeds)。字命中在沿着直至能够增加累积比对评分的每一序列的两个方向上延伸。当累积比对评分从其最大达到值下降量X;由于一个或多个负评分残基比对的累积使累积评分变成零或更低;或任一序列的末端到达时,对在每一方向上字命中的延伸就停止。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用11的字长(W),50的BL0SUM62评分矩阵(参见HenikoffandHenikoff(1992)-10919)比对(B),10的期望值(E),M=5,N=4和双链对照作为缺省值。BLAST算法进行两序列之间类似性的统计分析;参见例如,KarlinandAltschul(1993):5873_5787。通过BLAST算法提供的一种类似性度量是最小和概率(P(N)),其提供了一个概率指示,通过该概率指示两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配就会偶然出现。例如,如果在第一序列与第二序列的比较中最小和概率低于约1,,,,则该序列被认
为类似于另一序列。典型地,当比较所有蛋白或任何以上提及的邻近氨基酸(contiguousaminoacids)的长度时,同源蛋白不同于相关蛋白至少、或少于2、5、10、20、40、50或60个突变(其每一个都可以是取代、插入或缺失)。本发明的CYP102A1酶的酶活性典型地在体外采用本文中所提及的任何底物或条件进行测定,并作为NADPH氧化速率,产物生成速率和结合效率(couplingefficiency)给出。速率是转化频率并以(nmolNADPH)(nmolCYPli^Air1(πηΓ1或(nmol产物)(nmolCYPl02A1)―1(min)―1给出。结合效率是用于产物生成所消耗的NADPH的百分数,S卩,理论最大效率的百分数。本发明的CYP102A1酶(例如,当用于本发明的方法中时)可以典型地具有至少1%,如至少2%、4%、6%、10%、20%、40%、80%或更大的结合效率。CYP102A1酶(例如,当用于本发明的方法中时)典型地具有至少ZmirT1,如至少4、10、15、20、25、50、100、200、300、SOOJOOUOOOdOOOmirT1或更大的产物生成速率。在形成多于一种产物(这是一种常见的情况)的情况下,产物生成速率表示形成的所有氧化产物的总量。在一些实施方式中,测量特定氧化产物的产物生成速率,即,可以测量并非所有的氧化产物。本发明的突变CYP102A1酶显示出相对于相应的野生型CYP102A1酶的增强的单加氧酶活性和/或改变的选择性。增强的单加氧酶活性可以根据增加的结合效率或增加
的产物生成速率采用一种或多种用于氧化的底物进行表征。增加的结合效率或增加的产物生成速率可以在或可以不在被突变CYP102A1酶利用的所有底物中共享。突变CYP102A1酶典型地表现出比该野生型酶的结合效率大至少10%、20%、50%、100%、500%、1000%或1500%的结合效率。突变CYP102A1酶也可以具有比该野生型酶的产物生成速率大至少50%、100%、150%、500%、1000%、2000%、5000%、10000%的产物生成速率。应该理解到,本发明的突变CYP102A1酶也可以显示出相对于相应的野生型酶和文献中所公开的突变体的其他改变的特性,使得这些效应可以包括但也不限于增强的单加氧酶活性。例如,突变酶可以显示出改变的底物特异性,允许优先利用特异性底物,或可以显示出单加氧酶活性,其中野生型酶或已知的突变体并不能氧化底物有机化合物。本发明的突变酶也可以显示出改变的产物选择性,其中由野生型以较小比例形成的产物成为突变体的优势产物,或以较小比例或根本不由野生型形成的新产物成为大多数或优势产物。下面描述突变酶和通过该突变酶实施的氧化过程的另外的改变的特性。突变CYP102A1酶在CYP102A1的位置117、131、191、215、276、307、330、377、401、403和425中的一个或多个处包括取代。典型地,它们可以在2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个以上定义的位置处包括取代。在一个优选的实施