由葡萄糖和乙醇酸进行3-羟基酸的微生物生产的制作方法.docx

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专利名称:由葡萄糖和乙醇酸进行3-羟基酸的微生物生产的制作方法
技术领域:
本发明涉及通过重组基因表达来生产3-羟基酸,例如3,4-二羟基丁酸和3-羟基丁内酯。
背景技术:
3,4_二羟基丁酸(DHBA)和3_羟基丁内酯(3-HBL)是非常有用的手性中间体,可用于合成他汀类药物(如CRESTOR和LIMTOR)、肉碱和其它精细化学品。在2003年和2004年,他汀类药物每年的市场估计是100-150亿美元,而肉碱(用作维生素补充剂)的年需求量估计为几百吨。DHBA和3-HBL还可容易地衍生为有价值的化合物例如肉碱,每克肉碱的成本为约5美元,其用作维生素和营养补充剂。目前尚无市售的DHBA,而3-HBL的成本为每克30-100美元。这些化合物的高成本和低可得性提高了他汀类药物的成本。现有的DHBA和3-HBL合成方法依赖于原始的苛刻的化学合成方法,例如苹果酸的苛性还原或者用酸分解各种己糖。这些化学合成方法产生几种副产物,需要对DHBA或3-HBL产物进行复杂纯化。这些缺点使DHBA和3-HBL的化学合成相对缺乏吸引力且不经济。
发明内容
本文描述了在细胞(例如大肠杆菌()细胞)中制备3-羟基酸(例如3,4-二羟基丁酸(DHBA)和3-羟基丁内酯(3-HBL))的高效的生物学方法。所述方法色括利用重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、atoB或bktB基因中至少之一和(3)phaB、Sl或hbd基因中至少之一并且任选地重组表达tesB基因和/或编码乙醇酸还原酶之基因的细胞作为合成DHBA和3-HBL的高效和有成本效益的工具。本发明的方面涉及重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、at0B或WitB基因中至少之一和C3)phaB或Wxl基因中至少之一的细胞。在某些实施方案中,所述细胞还重组表达tesB基因和/或编码乙醇酸还原酶的基因。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中,所述细胞是细菌细胞,例如大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。或者,应当理解的是,并非所有的基因都需要在与本发明方法相关的细胞中重组表达。在其中一个或更多个与本发明相关之基因在细胞中内源性表达的实施方案中,则细胞不必需要重组表达在所述细胞中内源性表达的一个或更多个基因。在这些实施方案中,所述细胞可另外重组表达所述通路中未在所述细胞中内源性表达的任意基因。在一些实施方案中,所述pet、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。在一些实施方案中,所述
pet、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。在某些实施方案中,所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌(Ralstoniaeutropha)基因,例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中,所述pet基因是埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)基因例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中,所述tesB基因是大肠杆菌(EscherichiaColi)基因,例如大肠杆菌K12基因。在一些实施方案中,所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属O^eudomonas)基因或酵母属(Saccharomyces)基因。本发明的某些方面涉及生产DHBA和/或3-HBL的方法,所述方法包括培养与本发明相关的细胞来生产DHBA和/或3-HBL,并任选地从所述细胞回收DHBA和/或3-HBL。在一些实施方案中,所述细胞是在葡萄糖和/或乙醇酸和/或丙酸的存在下培养的。本发明的一些方面涉及制备具有提高的DHBA和/或3-HBL生产的细胞的方法,包括在所述细胞中重组表达(l)pct基因、0)phaA、thil、at0B或WitB基因中至少之一以及(3)phaB或hbd基因中至少之一。在一些实施方案中,所述细胞还重组表达tesB基因和/或编码乙醇酸还原酶的基因。在一些实施方案中,为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸和/或丙酸。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中,所述细胞是细菌细胞,例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中,
所述细胞表达recA和/或endA。在某些实施方案中,所述细胞是大肠杆菌MG1655(DE3)细胞。在一些实施方案中,所述pet、phaA、thil,atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。在一些实施方案中,所述pct、phaA、thi1、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。在某些实施方案中,所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌基因,例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中,所述pet基因是埃氏巨球形菌基因,例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中,所述tesB基因是大肠杆菌基因,例如大肠杆菌K12基因。在一些实施方案中,所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或酵母属基因。本发明的一些方面涉及由细胞培养物产生的DHBA,其中所述细胞培养物中的细胞已被基因修饰以重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、atoB或I^ktB基因中至少之一和(3)PhaB或hbd基因中至少之一。在一些实施方案中,所述细胞还重组表达tesB基因和/或乙醇酸还原酶。在一些实施方案中,为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中,所述细胞是细菌细胞,例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中,所述
pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。在一些实施方案中,所述pct、phaA、thi1、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。在某些实施方案中,所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌基因,例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中,所述pet基因是埃氏巨球形菌基因,例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中,所述tesB基因是大肠杆菌基因,例如大肠杆菌K12基因。在一些实施方案中,所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或酵母属基因。本发明的一些方面涉及由细胞培养物产生的3-HBL,其中所述细胞培养物中的细胞已被基因修饰以重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、atoB或WitB基因中至少之一和(3)phaB或hbd基因中至少之一。在一些实施方案中,所述细胞还重组表达tesB基因和/或乙醇酸还原酶。在一些实施方案中,为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中,所述细胞是细菌细胞,例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中,所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。在一些实施方案中,所述pct、phaA、thi1
、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。在某些实施方案中,所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌基因,例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中,所述pet基因是埃氏巨球形菌基因,例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中,所述tesB基因是大肠杆菌基因,例如大肠杆菌K12基因。在一些实施方案中,所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或酵母属基因。在一些实施方案中,表达本文所述重组途径的细胞还表达recA和/或endA。在某些实施方案中,所述细胞是大肠杆菌MG1655(DE3)细胞。在一些实施方案中,对本文所述重组细胞的细胞培养物的上清液进行内酯化。本发明的一些方面涉及通过培养与发明相关的任意细胞而产生的细胞培养物。在一些实施方案中,所述细胞培养物包含至少200mgI^DHBA。在某些实施方案中,所述细胞培养物包含至少IgL4DHBA。在一些实施方案中,所述细胞培养物包含至少IOmgLl-HBL。在某些实施方案中,所述细胞培养物包含至少IOOmgL—1或至少500mgL—j-HBL。本发明的一些方面涉及通过培养与发明相关的任意细胞而产生的细胞培养物的上清液。在一些实施方案中,所述上清液包含至少ZOOmgl^DHBA。在某些实施方案中,所述上清液包含至少IgI^DHBA。在一些实施方案中,所述上清液包含至少IOmgLl-HBL。在某些实施方案中,所述上清液包含至少
IOOmgL—1或至少500mgL—j-HBL。在一些实施方案中,对所述上清液进行内酯化。在某些实施方案中,内酯化是通过酸化以降低所述上清液的PH来实现的。在一些实施方案中,内酯化是通过DHBA-CoA的自身内酯化来实现的。
附图不是旨在按比例绘制的。在附图中,各个图中示例的每个相同或几乎相同的要素以相似的数字表示。为清楚起见,并非每一个要素都可标记在每一附图中。在附图中图1是描述3-羟基链烷酸途径的示意图。pet的存在产生与乙酰CoA缩合反应中使用的酰基CoA分子。图2是描述对本文所用的3-羟基链烷酸途径进行改动以用于合成DHBA的示意图。图3是描述通过表达tesB、pet,3种乙酰乙酰-CoA硫解酶(thil、bktB或phaA)之一以及两种3-羟基丁酰基-CoA还原酶(phaB或IAd)之一的重组大肠杆菌来生产3HV的图。图4描述3HV甲酯的HPLC谱。图4A代表含有两种立体异构体()的外消旋3HV标准品;图4B是来自表达ptb-buk、phaB和I^ktB的大肠杆菌的培养基,;图4C是来自表达ptb-buk、tibd、bktB和tesB的大肠杆菌的培养基,。与pet相似,所述ptb-buk操纵子编码***丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的舞酸丁酉先转移Bl(phosphotransbutyrase,ptb)禾口丁酉先激酶
(butyrokinase,buk),其作用是由丙酸产生高水平的丙酰CoA。所有样品在HPLC分析之前在酸性甲醇中煮沸以形成3HV甲酯。(R)_3HV和(S)_3HV。图5描述表达不同3-羟基链烷酸途径基因的重组大肠杆菌MG1655(DE3)endA_recA_*DHBA(左栏)和3-HBL(右栏)的产量。每个途径中所用的具体基因以X轴表不。图6是显示证明重组大肠杆菌所产生的DHBA产量的液相色谱一质谱(LC/MS)谱图的图。“A”线表示DHBA标准品,而“B”线是表达phaA、phaB、pCt和tesB的重组大肠杆菌所产生的DHBA。“C”线是阴性对照。MS信号是m/z=138的离子曲线,其表示质子化DHBA的铵加合物。图7是显示证明重组大肠杆菌所产生的3-HBL产量的液相色谱一质谱(LC/MS)谱图的图。“A”线表示3-HBL+DHBA标准品,而“B”线是在乙醇酸和葡萄糖存在下表达phaA、phaB、pet和tesB的重组大肠杆菌培养物所产生的3-HBL。“C”线是阴性对照。MS信号是m/z=120的离子曲线。图8描述在存在或不存在tesB的情形下表达不同3_羟基链烷酸途径基因的重组大肠杆菌MG1655(DE3)endA>ecA"中DHBA(左栏)和3-HBL(右栏)的产量。每个途径中所用的具体基因显示在X轴上。图9描述在tesB和pet存在下表达不同3_羟基链烷酸途径基因的重组大肠杆菌MG1655(DE3)endA—recA—中
DHBA(左栏)和3-HBL(右栏)的产量。右侧三个样品表示当用酸处理左侧三个样品时所达到的产物滴度。每个途径中所用的具体的乙酰乙酰CoA硫解酶和3-羟基丁酰CoA还原酶显示在X轴上。图10描述96小时后表达bktB、phaB、pet和tesB的重组大肠杆菌MG1655(DE3)中3-羟基链烷酸途径的产量谱。显示了11种独立培养物所消耗的葡萄糖和乙醇酸的平均水平以及醋酸、3HB、DHBA和3-HBL的平均水平,误差线表示标准差。图11描述96小时后表达bktB、phaB、pet和tesB的重组大肠杆菌MG1655(DE3)的最高产培养物中DHBA(左栏)和3-HBL(右栏)的产量。对该培养物进行过夜酸处理以催化内酯化,所得DHBA和3-HBL水平显示在该图右侧。图12描述由葡萄糖和乙醇酸生产DHBA和3-HBL的3_羟基链烷酸途径方案,标出了DHBA-CoA的分支点。随着重组tesB的表达,该途径产生的DHBA比3-HBL多(图8),然而,在无tesB的情形下,产生更多的3-HBL,几乎不产生DHBA,这表明DHBA-CoA可在体内自
8身内酯化为3-HBL。在此,所述途径以I^ktB和phaB表示乙酰乙酰CoA硫解酶和3-羟基丁酰基CoA还原酶,因为显示这对基因产生的DHBA和3-HBL水平最高(图5)。图13描述含有pet(右栏,pct-tesB)和没有pet(左栏,tesB)的大肠杆菌MG1655(DE3)recA-endA-中3-羟基链烷酸途径48小时后的醋酸产量。无pet的实验是一式三份进行的,而那些含有
Pct的实验代表单次试验。
具体实施例方式之前用于合成DHBA和3-HBL的方法依赖于原始的苛性的化学合成方法,而生物生产DHBA和3-HBL尚未被认为是一种选择。事实上,尽管能源部的最近报告已将3-HBL列入来自生物质的十大增值化学品中(Werpy和Petersen,2004),但是这份报告还声称用于3-HBL合成的生物途径是“不太可行”的,而提倡开发更好的3-HBL化学合成方法。本文描述了可以通过涉及细胞中重组基因表达的生物学方法来产生DHBA和3-HBL这一出乎意料的发现。本发明的方法和组合物涉及在重组表达一种或多种基因(包括pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、Sl、hbc^ntesB)的细胞中生产DHBA和3-HBL。该系统代表了生产具有广泛应用的DHBA和3-HBL分子的一种高效的新方法。本发明的应用不限于其在下文说明书所述或附图所举例说明的对要素的组织和安排的细节上。本发明能够用于其它实施方案并且可以多种方式实施或进行。此外,本文所用的短语和术语是用于描述的目的,而不应被视为限定。本文所用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式旨在包括下文列举的项目及其等同物以及其它项目。3-羟基链烷酸途径本文所述的方法和组合物应用3-羟基链烷酸途径从糖及糖衍生底物合成3-羟基酸(例如3-羟基丁内酯(3-HBL)和/或其水解形式3,4_二羟基丁酸(DHBA))。本文所用的“羟基酸”