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专利名称:用随机引物和特异性引物的混合物等温扩增核酸的制作方法
用随机引物和特异性引物的混合物等温扩增核酸相关申请的交叉引用
本申请要求保护于2010年2月9日提交的美国专利申请号12/702,884的优先权,其公开内容通过引用以其整体并入本文。关于联邦政府资助研究与开发的声明
本发明在政府资助下进行,合同号为由国防威胁降低局授予的HDTRA1-07-C-0097。政府拥有本发明某些权利。发明领域本发明通常涉及用于等温链置换核酸扩增的方法和试剂盒。所述方法具体涉及用随机引物和特异性引物的混合物等温扩增核酸。
背景技术:
目前许多技术用于扩增核酸,甚至从几个分子的起始核酸模板开始扩增。这些技术包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维续序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)或滚环扩增(RCA)。核酸扩增技术经常用于基于核酸的测定,其用于分析物检测、传感、法医和诊断应用、基因组测序、全基因组扩增等。所述应用常常要求扩增技术具有高特异性、灵敏度、准确性和稳健性。当可用的起始模板核酸为极小量时,核酸扩增尤其重要。然而,大多数目前可利用的核酸扩增技术受到通过产生不需要的
/假的扩增产物的非特异性扩增反应而产生的高本底信号的影响。用等温扩增条件可以以更高的准确性和容易性实现自生物样品的核酸扩增和分析。等温扩增方法相对于热循环方法(例如PCR)的主要优势是通过避开对热循环仪的需要而用最少仪器实施反应的能力。用于等温扩增的仪器可以利用受控的加热块或水浴,使得所述技术更易获得、更方便和更经济。此外,许多等温扩增技术,例如滚环扩增、全基因组扩增或环介导的等温扩增(LAMP),可以不需要事先纯化靶标核酸,直接用含有靶标核酸的粗生物材料来实施。然而,在某些特定应用中,例如全基因组扩增中,当采用现有扩增方法时,一些特定的目的基因座可在扩增过程中丢失。因此,需要开发设计为保存模板核酸中存在的所有必需序列的更好的等温扩增方法。简述
本发明的一个或多个实施方案提供了用于有效扩增核酸的方法和试剂盒。在一些实施方案中,提供了在等温条件下利用特异性引物和包含随机序列的引物的核酸扩增方法。在一个实施方案中,提供了用于核酸扩增的方法。所述方法包括提供核酸模板、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含随机序列的引物和特异性引物。所述方法包括在等温条件下扩增核酸模板以形成扩增的核酸序列。在用于核酸扩增的方法的另一实施方案中,所述方法包括提供核酸模板、
DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含随机序列的引物和特异性引物。所述方法包括在等温条件下扩增核酸模板以形成与表面连接的扩增的核酸序列。
在另一实施方案中,提供了用于核酸扩增的试剂盒。所述试剂盒包括Phi29DNA聚合酶、至少一种包含随机序列的引物和至少一种特异性引物。附图
当参考附图阅读以下详述时,本发明这些和其它特征、方面和优势将变得更好理解,附图中相似符号在全部附图中代表相似部分,其中
图I是滚环扩增反应、通过珠粒结合的特异性引物对扩增的脱氧核糖核酸(DNA)的捕获和捕获的DNA的进一步扩增的示意图。图2是在珠粒上的等温滚环DNA扩增反应示意图,其显示了用随机引物让DNA从一个珠粒转移到另一个珠粒。图3是显示珠粒结合的DNA与表面结合的引物杂交和表面结合的引物的进一步延伸以在表面捕获DNA拷贝的图。图4A是用扩增的DNA和捕获的DNA包被的单个珠粒的图像。图4B显示没有任何扩增DNA包被的单个珠粒。图5是阐明与阴性和阳性对照(泳道3和4)相比的通过珠粒结合的特异性引物捕获的扩增PUC18DNA的EcoRI限制性酶消化产物(泳道2)的琼脂糖凝胶图像。图6是阐明在不同条件下通过珠粒结合的特异性引物捕获的扩增DNA的EcoRI限制性酶消化产物的琼脂糖凝胶图像。图
7是在珠粒上捕获的扩增的DNA(SEQIDNO:2)的测序数据图。详述
包括单分子DNA扩增或全基因组扩增的基于核酸的测定,需要就序列覆盖率而言具有高收率、高保真度和小偏倚的高效核酸扩增方法。采用包含随机序列的引物的诸如滚环扩增(RCA)或多重置换扩增(MDA)等等温核酸扩增反应,对于所述应用比温度依赖性核酸扩增反应(如PCR)更合适。本发明一个或多个实施方案涉及用于有效等温扩增核酸的方法和试剂盒。在一些实施方案中,所述方法包括采用两种类型的引物的核酸模板体外扩增,所述两种类型的引物为包含随机序列的一种引物和特异性引物。在一些实施方案中,所述方法包括采用包含随机序列的引物和特异性引物体外扩增核酸模板,所述随机序列包含核苷酸类似物。所述方法部分地提高核酸扩增反应的效率。所述方法进一步包括用与基质或捕获剂(或者术语“捕获剂”在本文中用作“捕捉剂”)连接的特异性引物捕获扩增的核酸序列。为了更清晰和简明地描述和指出所要求保护的发明的主题,为用于以下说明和附加权利要求中的特定术语提供以下定义。在整个说明书中,特定术语的例证应该被视为非限制性实例。除非上下文中另外明确指出,否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数所指物。如本文整个说明书和权利要求中所用,近似措词可以用于修饰在不引起改变与其相关的基本功能的情况下可允
许改变的任何定量性表述。因此,由术语例如“约”修饰的值不限于规定的精确值。在一些情况中,近似表措词可相当于检测值的仪器的准确值。相似地,“不含(free)”可以与术语联合使用,可包括少量或痕量,而仍认为不含所修饰术语。在必要时提供了范围,那些范围包含了它们之间的所有子范围。本文所用术语“核苷”指葡基***化合物,其中核酸碱基(核碱基)与糖部分连接。核酸碱基可以是天然核碱基或修饰的/合成的核碱基。核酸碱基可以包括但不限于嘌呤碱基(例如腺嘌呤或鸟嘌呤)、嘧啶(例如胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶)或脱氮杂嘌呤碱基。核酸碱基可以连接至戊糖(例如核糖或脱氧核糖)糖部分的I’位置或等同位置。所述糖部分可以包括但不限于天然糖、糖取代物(例如碳环部分或无环部分)、取代糖或修饰糖(例如在锁定核酸(LNA)核苷酸中的双环呋喃糖单元)。核苷可以含有2’-羟基、2’-脱氧或2’,3’-双脱氧形式的糖部分。本文所用术语“核苷酸”或“核苷酸碱基”指核苷磷酸。所述术语包括但不限于天然核苷酸、合成核苷酸、修饰核苷酸或代替物取代部分(例如肌苷)。核苷磷酸可以是核苷单磷酸、核苷双磷酸或核苷三磷酸。核苷磷酸中的糖部分可以是戊糖,如核糖,并且磷酸酯化位点可对应于与核苷戊糖C-5位置连接的羟基。核苷酸可以是但不限于脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)或核糖核苷三磷酸(NTP)。可以用英文字母(字母命名)表示核苷酸,如表
I所示。例如,A表示腺苷(即含有腺嘌呤核碱基的核苷酸),C表示胞嘧啶,G表示鸟苷,T表示胸苷。W表示A或T/U,而S表示G或C。N代表随机核苷酸(即N可以是A、C、G或T/U中的任一个)。字母命名前的加号(+)标记表示该字母命名的核苷酸是LNA核苷酸。例如,+A代表腺苷LNA核苷酸,+N代表随机的锁定核苷酸(随机LNA核苷酸)。字母命名前的星号(*)标记表示由该字母命名的核苷酸是硫代磷酸酯修饰的核苷酸。例如,*N代表硫代磷酸酯修饰的随机核苷酸。表I:不同核苷酸的字母命名
字母符号j由字母符号代表的核苷酸
G_G_
~~_
T~—
C~—
U~—
FG^A—
TTTiI或c—
M~A^C—
FT/U~
S~G^C—
FT/U~
FC或T/U_
FT/U或C-
~⑩C或A~
FA或T/U_
~Ig或A或T/U或C-
本文所用术语“核苷酸类似物”指与天然核苷酸结构上相似(类似物)的化合物。核
苷酸类似物可以具有改变的磷酸酯骨架、糖部分、核碱基或其组合。通常具有改变的核碱基
的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积特性。具有改变的磷酸酯-糖骨架的
核苷酸类似物(例如肽核酸(PM)、锁定核酸(LNA))通常尤其改变链特性,例如二级结构形成。本文所用术语“LNA(锁定核酸)核苷酸”指核苷酸类似物,其中核苷酸的糖部分包含锁定于模拟核糖核酸(RNA)的糖构象中的双环呋喃糖单元。从化学角度看,自脱氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)到LNA核苷酸的结构改变受到限制,即在2’位和4’位碳原子之间引入另外的键(例如2’-C,4’-C-氧亚***键)。LNA核苷酸中呋喃糖单元的2’和4’位可以由O-亚***(例如氧-LNA:2’-0,4’-C-亚***-P-D-呋喃核糖核苷酸)、S-亚***部分(硫代-LNA)或NH-亚***(氨基-LNA)等等连接。所述键限制了呋喃糖环的构象自由。LNA寡核苷酸表现出对互补单链RNA和互补的单链或双链DNA增强的杂交亲和力。LNA
寡核苷酸可诱导A型(RNA样)双链体构象。本文所用术语“寡核苷酸”指核苷酸或其衍生物的寡聚体。本文所用术语“核酸”指核苷酸或其衍生物的聚合物。本文所用术语“序列”指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。在整个说明书中,无论何时寡核苷酸/核酸由字母序列表示时,核苷酸从左到右是5’一3’次序。例如,由字母序列(W)x(N)y(S)z代表的寡核苷酸(其中x=2、y=3和z=l),代表寡核苷酸序列WWNNNS,其中W是5’末端核苷酸,S是3’末端核苷酸。寡核苷酸/核酸可以是DNA、RNA或其类似物(例如硫代磷酸酯类似物)。寡核苷酸或核酸也可以包括修饰的碱基和/或骨架(例如修饰的磷酸酯键或修饰的糖部分)。赋予核酸稳定性和/或其它优势的合成骨架的非限制性实例可以包括硫代磷酸酯键、肽核酸、锁定核酸、木糖核酸或其类似物。本文所用术语“引物”或“引物序列”指与靶标核酸序列(例如待扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应的短的线性寡核苷酸。引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可以含有天然的、合成的或修饰的核苷酸。引物长度的上限和下限均凭经验确定。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下与靶标核酸杂交时形成稳定双链体所需的最小长度。非常短的引物(通常少于3-4个核苷酸长度)在所述杂交条件下不能与靶标核酸形成热力学稳定的双链体。上限通常决定于在靶标核酸的非预定核酸序列的区域中形成双链体的概率。适合的引物长度范围通常为约
4-约40个核苷酸长度。本文所用术语“包含随机序列的引物”指引物序列的混合物,所述序列通过以使得给定位置可由任何可能的核苷酸或其类似物组成的方式(完全随机化)随机化寡核苷酸序列任何给定位置的核苷酸来产生。在一个实例中,引物可为“随机引物”或“完全随机引物”或“嵌合随机引物”。因此,随机引物是由序列中每一种可能的核苷酸组合组成的寡核苷酸序列的随机混合物。例如,六聚体随机引物可以由序列NNNNNN或(N)6表示。六聚体随机DNA引物由4种DNA核苷酸A、C、G和T的每一种可能的六聚体组合组成,这导致产生包含46(4,096)种独特六聚体DNA寡核苷酸序列的随机混合物。当靶标核酸序列未知时,可将随机弓I物有效地用于引发核酸合成反应。本文所用术语“部分受限的引物”指引物序列的混合物,所述序列通过使寡核苷酸序列的一些核苷酸完全随机化(即所述核苷酸可以是A、T/U、C、G或其类似物中的任一种),同时限制一些其它核苷酸的完全随机化(即在某些位置的核苷酸随机化程度低于可能的A、T/U、C、G或其类似物的组合)来产生。例如,由WNNNNN代表的部分受限的DNA六聚体引物,代表了其中混合物中所有序列的5’末端核苷酸是A或T的引物序列混合物。与完全随机DNA引物(NNNNNN)的最多4种可能的组合(A、T、G*C)相比,此处的5’末端核苷酸限制于两种可能的组合(A或T)。部分受限引物的合适引物长度可在约