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专利名称::用于高通量亚硫酸氢盐dna-测序的方法和组合物及其用途的制作方法用于高通量亚硫酸氢盐DNA-测序的方法和组合物及其用途与相关申请的交叉引用本申请要求基于2007年8月15日申请的美国临时专利申请序列号60/935,472和2007年9月5日申请的60/935,867的优先权。上述临时申请的全部内容通过引用结合到本文中。本公开的
技术领域:
和摘要本发明涉及生产适用于化学修饰和高通量DNA测序的DNA模板的新颖方法和组合物。本发明的一种方法涉及DNA接头设计,其中组分胞嘧啶被5-***胞嘧啶取代,使所得接头对亚硫酸氢盐介导的脱氨作用具有抗性。当所述接头与双链DNA模板连接时,后续DNA变性和亚硫酸氢盐处理将模板DNA胞嘧啶差异脱氨形成尿嘧啶,而所连接接头的5-***胞嘧啶对这一化学转化具有抗性使得接头序列保持不变。因此可使用与未改变接头序列杂交的单一引物组扩增经亚硫酸氢盐处理的DNA两条链。本发明也涉及生产具确定***化组成的对照模板以优化适用于亚硫酸氢盐反应条件的方法。在一个优选的实施方案中,本发明可用于生产适于使用传统的SoleXaTM、S0LiDTM或454-型DNA测序平台进行全基因组亚硫酸氢盐
-DNA测序以研究DNA***化的模板。
背景技术:
:外遗调控(印igeneticregulation)的一个主要机制涉及DNA***化,藉此S-腺苷-甲硫氨酸的***被酶催化转移至胞嘧啶的5-碳位上得到5-***胞嘧啶(综述Caiafa和Zampiere,2005;Novik等,2002;Bird,2002;Costello和Plass,2001;Laird和Jaenisch,1996)。在人类中,绝大多数的胞嘧啶***化发生在CpG岛的CpG二核苷酸、G+C等容线和CpG热点上,但是位于CpNG、CC(a/t)GGXpA和CpT序列中的胞嘧啶也可被低频率***化(Lorincz和Groudine,2001;Woodcock等,1997;Clark等,1995)。调控区的CpG二核苷酸胞嘧啶***化促成基因沉默例如在X-染色体活化中并经常在癌症的肿瘤抑制基因沉默中发挥重要作用。已报导了致癌作用各种阶段以及许多其他疾病中不同基因组区域的低***化和超***化(综述Jones和Baylin,2007;Brena和Costello,2007;Esteller,2007;Rodenhiser和Mann,2006;Laird和Jaenisch,1996)。因此,需要表征被定义为基因组***化状态的“***化组(methylome)”的方法,以阐明可导致发现药物、药物作用靶或可用的疾病生物标记的调控网络。已研发了各种方法用于以不断增大的分辨率分析胞嘧啶***化以阐明调控网络并用于鉴定疾病的生物标记。用于测定胞嘧啶***化的最早方法是基于色谱法
(Hotchkiss,1948)但是其分辨率低,因为这一技术和其他相关技术只能观察到DNA中的整体***化变化。可分析***胞嘧啶分布更准确变化的分辨率提高的后续方法利用***-敏感性限制性核酸内切酶或亲和色谱法(Zhang等,2006;Cross等,1994)。胞嘧啶化学修饰偶联DNA测序仍然是外遗研究中以单个核苷酸分辨率检测5-***胞嘧啶的精选方法,即所谓“黄金标准”。“亚硫酸氢盐-DNA测序”化学的发展使得能够对胞嘧啶***化进行直接阳性检测。亚硫酸氢盐-DNA测序法来自20世纪70年代描述的化学,通过该方法亚硫酸氢钠催化胞嘧啶有效脱氨得到尿嘧啶(Shapiro等,1973;Shapiro等,1970;Hayatsu等,1970),其功能上等价于在测序和DNA扩增反应中的胸腺嘧啶。根据反应条件,5-***胞嘧啶脱氨形成胸腺嘧啶的速率可比胞嘧啶转化为尿嘧啶的速率慢大约两个数量级(Haystsu和Shiragami,1979;Wang等,1980)。Frommer等(1992)利用***胞嘧啶和胞嘧啶之间的选择性化学差异以及聚合酶链式反应(PCR),来提供位于单个DNA链上5-***胞嘧啶的阳性展示。从这一最初的报告和其他报告开始,亚硫酸氢盐-DNA测序法迅速成为并且仍然是用于在单核苷酸水平分辨率上研究靶基因座中胞嘧啶***化的精选方法(Ehrich等,2007;Grunau等,2001;Eads等,2000;Paulin等,1998;Clark等,1994;Raizis等,1995;Feil等,1994;Frommer等,1992)。近些年来尝试采用大规模全基因组
DNA***化检测的方法。这些尝试的第一个为“限制性标记基因组扫描”,其中通过连续分级分离用***-敏感性限制酶消化的末端标记DNA检测差异DNA***化(Hatada等,1991)。这一方法受到可获得性和基因组中限制性酶切位点分布的限制并且分辨率低。Olek等,(1998)(美国专利第6,214,556号)描述了另一种方法,藉此经亚硫酸氢盐处理的DNA与通过使用PCR的选择性完整基因组DNA扩增偶联。通过引物延伸测定检测被扩增的产物以得到可用于评价细胞***化状态的复杂DNA***化指纹图谱。所进行的引物延伸测定的数量指明这一方法的分辨率和基因组覆盖范围。另一策略是基于使用抗_***胞嘧啶抗体或***-CpG结合蛋白的***化DN***段亲和层析(Zhang等,2006;Cross等,1994)。***化拟南芥DNA的免疫沉淀和亲和色谱法与被捕获标记产物和基因组寡核苷酸嵌合芯片(tilingarray)杂交相偶联已产生了第一个全基因组***化图谱(Zhang等,2006)。所得***化图谱具有35-碱基分辨率,对应于嵌合芯片上寡核苷酸的长度。使用低分辨率阵列在人类癌细胞系上进行的相似研究已揭示大量的差异***化基因(Keshet等,2006;Weber等,2005)。尽管可用于全基因组扫描,但是这一方法受到阵列分辨率和在其可被亲和纯化捕获前DN***段上***-CpG的最低阈值浓度的限制。因此,需要相对大量的原料,因此排除了其在许多临床应用中的
用途。在本领域中明显需要只需更少量的原料并且在单个核苷酸水平上具有更高分辨率的更敏感的检测方法。直到最近,技术难题一直阻碍亚硫酸氢盐-DNA测序法在全基因组范围作图绘制***化变化的应用。在原理性试验的小规模验证中,Meissner等(2005)证实了使用亚硫酸氢盐-DNA测序法以单核苷酸分辨率作图绘制基因组DNA文库插入物5-***胞嘧啶的实际可行性。用亚硫酸氢盐处理大小经过选择的随机片段化基因组DN***段(装有接头),经PCR扩增并克隆至用于测序的载体中。%,表明基因组文库插入物的随机鸟枪法亚硫酸氢盐-DNA测序可应用于全基因组范围。然而,这一方法的用途是有限的,主要受到高成本和传统桑格双脱氧测序法低通量的限制。因此,本领域仍然存在对较低成本和更高通量的经改进的亚硫酸氢盐-DNA测序法的需要。下一代大规模并行DNA测序技术提供了高出若干个数量级的通量并且成本降低,但是这些平台仍然不适用于亚硫酸氢盐-DNA测序,做不到低成本全基因组地研究DNA***化。目前有三种市售的用于高通量DNA测序的系统基因组测序仪(TheGenomeSequencerFLX)系统(通常称作454_测序仪)(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN);Solexa(Illumina,SanDiego,CA);和SOLiD系统(AppliedBioSystems,FosterCity,CA)。454-技术基于传统的焦磷酸测序化学,其在经克隆扩增的
DNA模板上进行,这些模板在单个装载至高密度光学板刻蚀孔的微珠上(Margulies等,2005)。各次碱基延伸生成的信号被精密的光学纤维捕获。Solexa测序模板被固定至专有流动池表面,在那里它们被原位克隆扩增以形成密度高达一千万集簇每平方厘米的分离的序列模板集簇。使用引物介导的DNA合成以分步方式在四种专有的经修饰核苷酸(具有可逆3'双-脱氧核苷酸部分和可裂解的荧光生色团(chromofIuor))存在下进行Solexa测序。在各延伸循环之前化学移除3‘双-脱氧核苷酸部分和荧光生色团用于连续的碱基判定(basecalling)。来自各模板集簇的分步式核苷酸添加循环由激光激发检测,之后进行成像从而完成碱基判定。用于大规模并行DNA测序的AppliedBiosystems'SOLiD方法是基于连续的DNA连接循环,这是由哈佛大学GeorgeChurch创新的策略(Shendure等,2005)。通过这一方法,在微珠上克隆扩增固定化DNA模板(乳滴PCR),这些微珠以高密度置于玻璃流动池的表面。通过短的确定的标记探针连接至与固定化模板杂交的一系列引物的连续循环完成序列测定。这些新仪器每次运行的通量可超过数十亿碱基判定,是目前基于96-道毛细管电泳测序仪器的约一万五千或更多倍。因此,仍然存在对使亚硫酸氢盐-DNA测序化学适应454-,Solexa或SOLiD测序平台以便低成本全基因组地研究DNA***化的方法和组合物的需要。在他们的初步研
究中,Meissner等(2005)提出新一代454-DNA测序仪可提供经济的解决方案以使亚硫酸氢盐-DNA测序的全基因组应用得以进行,但是他们没有讨论关键问题也没有公开任何付诸实施的方法。更重要的是,研究者没有认识到将他们的方法应用至Solexa或SOLiD平台(典型的序列读取长度仅为35_50个碱基)的巨大困难。本发明提供这些和其他实质性益处。发明详述本发明提供在下一代DNA测序仪中使用的用于亚硫酸氢盐-DNA测序的新颖改进方法和可用组合物,以使大规模高通量全基因组研究胞嘧啶***化类型的改变得以实现并用于其它优选的应用。Meissner等(2005)的先导研究描述了亚硫酸氢盐-DNA测序方法,通过该方法首先将短DNA接头与多个大小经选择的随机片段化基因组DN***段的各个末端相连接。将与接头连接的DNA变性,得到对亚硫酸氢盐处理敏感的单链形式,其中原有(resident)胞嘧啶转化成尿嘧啶但是5-***胞嘧啶不发生改变。使用接头区的引物将已转化的DNA扩增重新生成DNA链并产生足够质量的经亚硫酸氢盐转化的DNA产物用于有效克隆至用于通过传统毛细管电泳进行测序分析的载体中。该研究显示该方法提供待测基因组DNA的无偏倚表现并且具有大规模应用的可行性。然而,Meissner等的亚硫酸氢盐处理靶DNA的重要后果是已连接接头中的所有胞嘧啶也被转化成尿嘧啶。因此,为了进行DNA扩增,将PCR引物设计成不与接头序列杂交而是设计成与经亚硫酸氢盐转化的接头序列杂交,这一策略是被称作
“***化-特异PCR"方法的基础(Cottrell,2004;Li和Dahlya(2002);Herman和8对1^1(1997)(美国专利第6,017,704号);Herman等,1996)。适用于扩增亚硫酸氢盐处理样品的本领域已知的其他适当PCR引物设计包括使用可从亚硫酸氢盐修饰位点扩增DNA的简并引物或使用靶向DNA无胞嘧啶区域的DNA的非常短的引物(Olek等,1998美国专利第6,214,556号)。如本领域所述的***化-特异PCR对引物设计的限制与现有ABISOLiD或IlluminaSolexa高通量测序平台的使用不相容。这些平台必须使用紧邻样品DNA插入物之后的经优化并经验证的专有接头序列。这些专有接头的功能为介导DNA测序模板的克隆固相扩增和测序引物的结合。Solexa和SOLiD测序仪的阅读长度仅为35个碱基(在2008年末延伸至50个碱基或以上)。位于专有接头和DNA插入物之间的外来序列例如***化-特异PCR所要求的那些将样品DNA本已较短的阅读长度降低至不可接受的水平。结果,如其所述目前的Solexa和SOLiD平台不能测序***化-特异PCR法生成的产物(Meissner等,2006;Cottrell,2004;Li和Dahlya,2002;Herman和Baylin,1997,美国专利第6,017,704号;Herman等,1996)。尽管可能形式上生成其中经亚硫酸氢盐转化的接头序列可介导固相载体上克隆扩增的接头设计和结合至
Solexa和SOLiD平台的测序引物,但是技术和经济上的难题是难以克服的。在接头上将胞嘧啶亚硫酸氢盐转化成尿嘧啶将有效减少遗传密码至仅三个碱基,因此严重限制了可有效并特异性用于平台所需固相扩增和高通量DNA测序的特异引物的设计。此外,亚硫酸氢盐转化使得接头的两条链不互补,因此需要生产和验证另一组用于其它样品DNA链的固相扩增引物和测序引物。已消耗了大量的公司经费、时间和资源研发并验证SOLiD和Solexa测序平台的现有接头和引物设计;对市场上现有产品的主要设计改变将产生不可接受的财务负担。454-测序仪的读取长度为数百个碱基并且在样品DNA模板中加入***化-特异PCR引物将减少读取长度。然而,去除454-模板中的外来序列将增加该平台的效率。本发明提供将现有基于SOLiD、SoIexa或454-的DNA测序平台适用于测序亚硫酸氢盐处理的DNA样品以研究DNA***化的新颖、简便、有效并且低成本的方法。本发明的一方面创造了新颖的接头组合物,其中组分胞嘧啶被5-***胞嘧啶取代使得所述接头对所结合模板DNA的亚硫酸氢盐处理过程中的脱氨作用具有抗性。当本发明接头与模板DNA连接时,DNA变性并且亚硫酸氢盐处理将模板DNA胞嘧啶转化成尿嘧啶,接头序列保持不变。因此可使用与原来未改变的接头序列互补的单个引物组扩增经亚硫酸氢盐处理的DNA两条链。相反,传统接头的胞嘧啶经亚硫酸氢盐处理转化成尿嘧啶使得必须使用与经亚硫酸氢盐转化的接头序列杂交的
PCR引物扩增经亚硫酸氢盐处理的模板。亚硫酸氢盐处理也使得两个DNA模板链不互补。亚硫酸氢盐处理也使传统接头的两条链不互补,致使需要分离的引物组来扩增各DNA链。本发明的接头组合物不存在这一问题,两个接头链保持互补并且单一引物组足以扩增经亚硫酸氢盐处理的两条链用于制备在SoleXa、S0LiD或454-测序平台上测序的模板。这些已建立的平台采用本发明预期引起很少或没有材料消耗,因为这些平台的专有接头的一级序列没有改变,因此,所有的下游操作例如固相DNA扩增和测序引物结合均不受影响。在优选的实施方案中,本发明的一方面可用于生产试剂盒或试剂盒组件,用于制备在S0LiD、SoleXa、454-或其他测序平台上高通量亚硫酸氢盐-DNA测序以进行***化研究的DNA模板。试剂盒组件与传统测序供应商提供的那些基本相同,除了简单并低成本地在接头中用5-***胞嘧啶替换胞嘧啶。通常,一个接头包括两个短的互补DNA寡核苷酸链,其包含天然的或使用本领域已知的合成路径通过化学或酶辅助合成生产的经修饰的寡核苷酸(综述=Verma和Eckstein,1998;Goodchild,1990)。包含例如***与胞嘧啶的5-碳位结合生成5-***胞嘧啶的经修饰碱基的寡核苷酸可从许多供应商获得,包括Operon(Cologne,Germany);Sigma-Proligo(Paris,France);和Genosys(,MO)。除了化学合成,可能使用***转移酶将接头