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专利名称:用于dna测序和dna鉴定的方法和装置的制作方法
技术领域:
本发明总体上涉及用于核酸分析的方法和装置,尤其是用于DNA测序的方法和装置。
背景测定DNA样品中四种核苷酸序列的速度是分子生物学、医学、和生物技术进一步发展的一个主要的技术障碍。从1978就开始使用了凝胶分离DNA分子而进行DNA测序的方法。唯一可行的其它核酸测序方法是杂交测序(SBH)。
基于列阵的SBH方法对DNA分子进行分离、降解、合成或成像时,不要求单个碱基的分辨力。其最为普遍的改进方法,利用长度为K个碱基的短寡核苷酸进行错配辨别杂交,构成的K聚体寡核苷酸组成物的排列可因靶DNA而确定,序列可通过独特的重叠批量寡核苷酸而读出。
在SBH法序列的读出中,在分析的DN***段中由于随机或生物学原因重复出现的K-1寡核苷酸可加以特殊考虑。如果没有其它的信息,相对小的DN***段可被完全读出,如每一个碱基对(bp)被读多次。相对长的片段的读出中,不确定性可因K-1寡核苷酸重复出现而增加。如果测定的是突变的或类似的序列则该问题就不存在了。一个序列的已知信息可用以作为模板来组装一个类似的序列。
有几种利用杂交来测序的方法,在SBH格式1中,DNA样品被排成矩阵,标记的探针与样品杂交,带有相同一组样品DNA重复的膜可用以几种探针和/或多重探针的平行杂交。尼龙膜上DNA样品的矩阵杂交经过显影。每一矩阵可以重新利用多次。格式1对于批量进行大量样品测试非常高效。
在SBH格式2中,探针被排成矩阵,一个被标记的DNA样品片段与列阵的探针杂交。在这种情况下,一个片段的完全序列可以通过同时和列阵的探针进行的杂交反应而确定。在测定其他DN***段的序列时,相同的列阵的寡核苷酸可以重复使用。可通过格式2的印迹或原位杂交的方法而产生矩阵,DNA锚排成矩阵并连接以确定合成寡序列,已证明有特异杂交。在一种格式2的改进方法中,DNA锚排成矩阵并连接而确定了靶DNA末端的寡序列。
在SBH格式3中,使用了两套探针,一套用于排成矩阵,另一套标记后存于多孔板中。在此情形中,靶DNA不需标记。靶DNA和一标记的探针加入到那套列阵的探针中。如果一个附带的探针和一个标记的探针与靶DNA上相邻位置杂交,那么它们可共价相连产生一个两倍长度的序列。这个方法可用于对长DN***段的测序,如完整细菌基因组,而无需亚克隆成小片段。
本发明中,SBH用于在短时间内有效地鉴定和测序一个或多个DNA样品。该方法已应用于DNA诊断、法医学和基因作图。它也可以用于鉴定引起遗传紊乱和其他性状的突变,用于分析生物多样性以及获得其它许多类型基于
DNA序列的数据。
发明概述如上所述,格式1的SBH利于同时分析大量的样品,对一个样品可在大矩阵上进行上千种样品的平行分析,或者利用小片膜的上千个独立杂交反应分析一些少量样品。DNA的鉴定可能涉及1-20个探针,而突变的鉴定可能在某些情况下要涉及1000多个为每一样品特别选择或设计的探针。为了确定突变DN***段的特性,要针对在第一轮杂交时检测的每一突变合成或选择特异的探针。
按照本发明,DNA样品可以备成小矩阵,其可以用合适的间隔分开,并可以同时用选自保存于多孔板中的寡核苷酸中的一套探针检测。该小矩阵可包括一个或多个样品,每一小矩阵中的DNA样品可以由突变体或一个序列的各个样品组成。形成较大矩阵的连续小矩阵可为相同矩阵的重复也可为不同的DN***段。一套通用探针含有能以预定精度分析任何DN***段的足够量的探针,比如要考虑其冗余量可读出每一bp。这套通用探针可以包括多于对一个特异片段所必需的、但对几千种不同序列的DNA样品的测试还不够的探针量。
DNA或等位基因的鉴定和诊断测序方法包括的步骤为1)从一套所提供的代表性的或通用的探针中选出一个子集用于与多个小矩阵中的每一个杂交;2)加入第一个探针到需平行分析的各个矩阵的每一个亚矩阵;3)进行杂交并分析结果;4)
去除前面已用的探针并重复将要使用的探针;5)处理已有的结果得出最终的分析或决定用另外的探针再杂交;6)对某些亚矩阵进行另外的杂交;并7)通过全套的数据计算得到最终的分析本发明解决了对一种类型的少量核酸样品(如DNA,RNA)快速鉴定和测序的问题;并可以利用一套预先合成的易控制大小的探针和以亚矩阵形式附着于支持物的样品平行分析许多样品类型。两种途径结合能得到一个高效、多用途的方法,用于DNA同一性的鉴定、DNA诊断和突变的鉴定。为了鉴定已知序列,可用一小套短探针替换一个长的特定探针。在此情形下,可能使用许多探针,但是可合成一套通用探针来覆盖所有的序列类型,比如,全套的6聚体或7聚体的探针分别只有4096个或16384个探针。
一个DN***段的完全测序需包括两个水平,一个水平是利用覆盖每一碱基至少一次的一套足够的探针进行的杂交。为此目的,要根据标准样品合成一套特异探针。这一杂交数据给出在非标准样品上是否和在何处存在突变(差异)。为确定此变化,要用另外的特异探针与样品杂交。在另一实施方案中,将一套通用探针中的所有探针都用于分析。
一套通用探针可使得毫不费时地以两步方法用对每个样品相对较少的探针来分析。杂交方法包括相继的探查,第一步算出一个优化的探针子集用于初次杂交,然后,根据得到的结果,第二步从该套通用探针中选定另外的探针进行分析。
使用样品矩阵中的一个矩阵可避免对单个样品或一小数量样品进行许多寡核苷酸的连续分析,此方法可就一个物理对象平行地进行多个探针分析。结合使用通用探针形成的亚矩阵和四步杂交方法,一个1000bp长度的DNA样品可以在相当短的时间里得到测序。如果样品在一矩阵中点成50个亚矩阵,且该矩阵与探针重复杂交10次,那么共用了500个探针,这一探针数是足够了。在扫描一个突变的存在时,约使用335个探针以覆盖每个碱基三次。如果突变存在,一些覆盖的探针则受到影响,这些阴性探针可以2个碱基的精度定位突变。为了解决用此精度定位单个碱基突变的问题,可再使用另外15个探针,这些探针覆盖了这2个可疑位置上存在的任何碱基组合(假设排除缺失和插入)。这些探针可以在含有所给样品的50个亚矩阵中进行一轮分析。在应用多标记颜色系统(multiplexing)时,2-6个标记有不同荧光染料的探针可以作为一个集合使用,从而减少杂交轮数并缩短测序过程。
在更为复杂的情形中,可能存在两个靠近的突变或插入,它们可以用更多的探针来处理,比如,一个3个碱基的插入要用64个探针来解决。最为复杂的情形可用几步杂交来处理,并根据先前的杂交结果选择一套新的探针。
如果亚矩阵由一种类型的几十个或几百个样品组成,那么其中的一些可能发现含有一个或多个变化(突变、插入、或缺失
)。对于每个存在突变的片段,可用一套特异的探针分析。分析一个类型样品的全部探针数可能要几百个。重复矩阵可平行使用上百个探针进行相对较少轮次的分析。此外,相容的探针可以集合使用。阳性杂交可归因于选择用于检查特定的DN***段的探针,因为这些片段的构成碱基通常有75%的差异。
利用较大一套长探针,可以很方便地分析较长的靶。这些靶可以是许多较小片段的集合,如外显子克隆的集合。
减少所需探针数量的多步骤方法,可使用特异杂交分析法确定来自一套二倍体染色体的待测序基因组片段中的杂合子(序列差异)的存在。这有两种可能性1)序列来自一个基本型的染色体和一个新的变异体的染色体;或,2)两条染色体都含有新的但不同的变异体。在第一种情况下,设计的定位变化的扫描步骤可在杂合位点得出2倍的最大信号差异。在第二种情况下,没有任何掩饰;需要更为复杂的探针选择来进行进一步的杂交。
在第一种情况中需要的2倍信号差异的分析可以通过将相应信号与来自基本序列型的对照信号和来自其它被分析样品的信号之间的比较而有效地进行。此方法可确定所给样品中每一个特定探针的杂交信号的相对降低程度。这点很有意义,因为特定的探针与含有其完全配对靶的不同DN***段的杂交效率可以变化达2倍。另外,杂合位点可根据寡核苷酸探针数量的多少而影响不止一个探针。
2-4个连续探针的信号的减少给出杂合位点存在的更明显的指示,该提示可通过几小套所选探针验证,这些探针中的一个或几个预计给出完全配对信号,其平均比来自错配双链的信号强8倍。
分隔膜可以非常灵活地组织实验,以容纳一个所给序列类型的大量样品、或者许多不同类型而每种类型样品数量较少的样品。可以非常有效地处理4-256个样品。可根据用于储存和标记寡核苷酸的标准多孔板的大小和构型来设计具有上述数量斑点的亚矩阵。亚矩阵的大小可根据样品的不同数量调整,或者可以用一些标准的亚矩阵大小。如果一种类型的所有样品不能在同一亚矩阵中容纳下,可使用另外的亚矩阵或膜并用相同探针分析。另外,通过调节每一亚矩阵的重复数量,鉴定和测序方法的完成时间会有变化。
优选实施方案的详细描述实施例1一套通用探针的制备制备了两种类型的通用探针套。第一类是相对短的一套完全(或至少是非互补的子集)的探针。如,所有4096(或约2000个非互补的)个6-聚体,或16384(或约8000非互补的)个7-聚体探针。8聚体和更长探针的完全非互补子集包括32000个或更多探针因而较为不便。
第二类探针套为探针小子集,用一个探针足以读出任何序列中的每个bp。比如,16个二聚体中的12个是足够的。用于双链DNA测序的7-聚体,8-聚体和9聚体的小子集分别约为
3000,10000和30000个探针。
探针用标准的化学法制备,末端为1-3个非特异碱基(A,T,C和G的混合物)或通用碱基(如M碱基,肌苷)。如果运用放射性标记,则探针可含有5′端OH基用于被放射性标记的磷酸基团激发。或者,探针用荧光染料标记。其它还使用了如PNA(蛋白核酸)或含有改变双链稳定性的修饰碱基的探针类型。
探针储存于多孔板。对于小量的探针可使用96孔板对于10000个或更多的探针,最好储存于384或864孔板。5-50个板可以足够储存所有探针。大约5pg的探针足够用于与一个DNA样品杂交。因此,以每个探针50μg的小量合成,可分析上千万个样品。如果每个探针用于每3个样品,并且如果每个样品为1000bp长,那么一套5000个的探针可测序300亿个碱基(10个人基因组)实施例2DNA样品的制备DN***段以M13、质粒或lambda载体上的克隆,和/或直接从基因组DNA或经PCR或其它扩增法得到的cDNA制备。样品可以在多孔板中制备或分装入多孔板。在2-500μl终体积中制备约100-1000ngDNA样品。
实施例3DNA矩阵的制备将DNA样品斑点印迹于一支持物如尼龙膜上而制备矩阵。可利用金属针矩阵(位置相对于多孔板的矩阵)反复将20nl的DNA溶液移至一个尼龙膜上而产生印迹。通过转印,斑点的密度比孔的密度要高。根据使用的标记类型可在
1平方厘米上容纳1-25个斑点。为了在预定的行和列不产生印迹,可形成分隔的子集(亚矩阵)。一个亚矩阵中的样品可以是来自不同个体的相同基因组DN***段(或相同基因),也可以是不同的重叠的基因组克隆。每一个亚矩阵可为相同样品印迹的重复。在一个实施例中,一个基因片段可扩增自64个患者,对于每个患者,扩增的基因片段置于一个96孔板上(全部96孔中的样品相同),制备一个含有64个患者样品多孔板。利用96针设备将所有样品印迹到一个8×12cm膜上,亚矩阵可含有64个样品,每个样品来自不同的患者。当96个亚矩阵相同时,其斑点大小为1mm且亚矩阵间间隔1mm。
另一个方法是使用带有物理间隔例如模塑于膜上的塑料格栅的膜或平板(NUNU,Naperville,Illinois有售),格栅类似于用于多孔板底部的膜,或使用疏水条。固定的物理间隔对于用平磷储存屏或X光曝光成象并不优选。
实施例4探针的筛选与标记含一系列亚矩阵的矩阵制备后,确定在每个亚矩阵上每一轮杂交所用的一套探针。对于实施例3中的样品,从通用探针中筛选出一套384个探针,共4轮每轮96个探针杂交。在一轮循环中优选含有类似G+C成分的探针。
将为每一循环选择的探针转至96孔板上,在储存之前,如探针还未标记则用激酶标记或用其它标记方法标记(如用稳定的荧光染料
)。
根据第一轮的杂交,对每个亚矩阵确定一套新的探针用于进一步的杂交循环。某些矩阵在某些循环中可能并不使用。例如,如果64个患者中的8个样品显示出一个突变,先用8个探针分析每个突变,然后在一轮中分析全部64个探针,32个亚矩阵则没有使用。这些亚矩阵随后可用杂交缓冲液处理以防干在滤纸上。
可以采用任何方便的方法从储存板上回收探针,比如单道进样器,或机器人工作站如BeckmanBiomek100(BeckmanInstruments,Fullerton,California)或MegaTwo机器人(Megamation,Lawrenceville,NewJersey)。机器人工作站可以结合使用数据分析程序和探针管理程序。这些程序的结果可以输入到一个或多个机器人工作站中去。
探针可以逐个回收并加入到已覆盖有杂交缓冲液的亚矩阵中。较为优选的是回收的探针放置于一个新的板中,标记或与杂交缓冲液混合。优选的回收方法是逐个取出储存板,并利用进样器(或用金属针移取)从每个板上吸取足够量的每种选用的探针移入一个中间板上的特定孔中。使用各自定位的进样器或进样针可以提高回收的速度。
实施例5杂交和分析方法可将标记探针与杂交缓冲液混合,并最好使用多道进样器进样至亚矩阵中。为了防止亚矩阵之间的探针相混(如果膜上没有疏水条或物理边界的话),可以用一个适当的塑料、金属或陶瓷格栅紧压在膜上。还有,可以减少缓冲液的体积至每