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用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌的制作方法
本发明涉及一种用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌BS04(BacillussubtilisBS04),属农业病害生物防治【技术领域】,其特征在于分离自辣椒根际土壤中,保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),其保藏编号为CCTCCNO:M2014294。本发明的枯草芽孢杆菌BS04对辣椒疫病菌、烟草黑胫病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和莴苣灰霉病菌的病原真菌具有抑菌作用,对原菌抑菌率在40%-80%之间,对辣椒疫病菌的抑菌率达80%以上。本发明的枯草芽孢杆菌BS04从健康植物根际的土壤中分离获得,无生态毒性,安全性高,抑菌谱广,且培养简单,周期短,在植物病害的生物防治中具有十分广泛的应用前景。
CCTCCNO:M2014294

【专利说明】用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌,属农业病害生物防治技术领域。
【背景技术】:
[0002]辣椒疫病俗称"死秧病",由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)引起,是主要的辣椒根茎病害之一,在我国及世界其他国家的辣椒生产区都严重发生,给辣椒生产造成巨
大的经济损失。
[0003]辣椒疫霉菌通常分布在土壤中,致病性变异强,易产生抗药性。目前,对于辣椒疫病的防治大多采用化学防治,而大量使用化学药剂导致了环境的严重污染,破坏了农业的生态平衡,对人类的身体健康产生了不利影响。同时,由于辣椒抗疫病品种较少,且多为中抗或耐病品种,难以有效地控制辣椒疫病。因此,寻找安全有效的防治措施成为控制辣椒疫病的一个亟待解决的问题。
[0004]在采用化学防治和培育抗病品种难以有效控制辣椒疫病发生的情况下,生物防治是目前辣椒疫病防治中重要的途径。在植物病害的防治上,生物防治具有对人畜安全,不污染环境,不产生抗性,以及由于仅杀伤或抑制防治对象,能参与生态环境调控,保持生态平衡,起到长效的作用,具有广阔的发展前景。
[0005]枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为目前应用较为普遍的生防菌,具有显著的生防能力,又是自然界中广泛存在的非致病细菌,且对人畜无害、不污染环境,备受各国研究工作者的青睐。
【发明内容】
:
[0006]为了克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种用于防治辣椒疫病的枯草
芽孢杆菌,从健康植物根际的土壤中分离获得,对辣椒疫病具有较高的防治效果,同时也对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、烟草黑胫病菌等多种病原菌具有拮抗作用,无生态毒性,安全性高,抑菌谱广。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]本发明的一种用于防治辣椒疫病的枯草芽孢杆菌BS04(BacillussubtilisBS04),分离自湖北省荆州市辣椒根际土壤中,已于2014年6月26日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC),其保藏编号为CCTCCN0:M2014294。
[0009]本发明采用平板稀释法从辣椒根际土壤中分离得到若干株根际细菌,并测定了对辣椒疫病菌的拮抗作用,筛选得到拮抗作用较强的BS04菌株,根据其菌落形态特征、生理生化特性及16SrDNA的序列测定,确定BS04菌株为枯草芽孢杆菌。
[0010]本发明采用平板对峙法测定了BS04菌株对辣椒疫病菌、烟草黑胫病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和莴苣灰霉病菌等病原真菌的拮抗作用,抑菌率在40%-80%之间,其中对辣椒疫病菌的抑菌率达80%以上。
[0011]本发明提供了BS04菌株培养液处理辣椒疫病菌后,辣椒病原菌的菌丝分支增多,顶端出现畸形,生长缓慢,还出现了细胞壁加厚,原生质浓缩呈球形或椭圆形的现象,表明
BS04菌株对辣椒疫病菌的菌丝生长具有明显的抑制作用。
[0012]本发明还通过对BS04菌株抗性的筛选,获得了卡那霉素抗性BS04突变株。将6叶期的辣椒幼苗在浓度为2X108cfu/mL的菌悬液中浸根处理,检测BS04菌株在辣椒根际的定殖规律。结果表明BS04菌株能够在辣椒根际定殖,处理后35天内定殖密度比较稳定。
[0013]本发明还测定了BS04菌株对辣椒疫病的应用防治效果,%。
[0014]中国典型培养物保藏中心用于专利程序的培养物保藏受理通知书(收据)
[0015]分类命名枯草芽孢杆菌BS04
[0016]保藏日期2014年6月26日
[0017]保藏单位中国典型培养物保藏中心地址:
[0018]保藏编号CCTCCNO:M2014294
[0019]本发明与现有的技术相比具有如下有益效果:
[0020]1、本发明的枯草芽孢杆菌BS04从健康植物根际的土壤中分离获得,无生态毒性,安全性高。
[0021]2、本发明的枯草芽孢杆菌BS04具有较广的抑菌谱,对常见的土传病原真菌(辣椒疫病菌、烟草黑胫病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌)及莴苣灰霉病菌等
具有较好的抑制效果。
[0022]3、本发明的枯草芽孢杆菌BS04菌株对辣椒疫病具有较高的防治效果,且培养简单,周期短,在植物病害的生物防治中具有十分广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明的BS04菌株的16SrDNA扩增电泳图。
[0024]图2为本发明的BS04菌株的16SrDNA的系统进化树图。
[0025]图3为本发明的BS04菌株处理辣椒疫病菌后的菌丝形态图。
[0026]图a:无菌水处理后辣椒疫病菌的菌丝形态图;
[0027]图b_d:BS04菌株处理后辣椒疫病菌的菌丝形态图。
[0028]图4为本发明的BS04菌株对不同病原真菌的抑制作用图。
[0029]图A:辣椒疫病菌;图B:烟草黑胫病菌;图C:棉花黄萎病菌;图D:棉花枯萎病菌;图E:油菜菌核病菌;图F:莴苣灰霉病菌。
【具体实施方式】:
[0030]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0031]实施例1:枯草芽孢杆菌BS04的分离、筛选与鉴定
[0032](1)分离与筛选:从湖北武汉、荆州、宜昌和荆门等辣椒种植区疫病发生严重的田地,利用五点采样法从健康辣椒根际采集土样。采样时铲去表层5cm的土层,取新鲜土样500g,用保鲜袋带回。
[0033]称取土样10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中,三角瓶中装有玻璃珠若干,28°C、120r/min振荡30min,静止后获得土壤悬液。
[0034]将土壤悬液稀释成1(Γ5、10'10'吸取不同稀释度的土壤悬液100μL涂布于NA培养基上,置于28°C培养48小时,挑取颜色、形态等不同的细菌单菌落并纯化、保存。
[0035]采用平板对峙法测定分离到的细菌对辣椒疫病菌的抑菌活性。将辣椒疫病菌在PDA平板上活化,用打孔器在菌落边缘打取菌块(直径5_),接种到PDA平板中央。培养1天后,在距离辣椒疫病菌块2cm处的4个对接点接种待测细菌,28°C培养,5天后观察抑菌结果,每个处理重复3次。试验结果表明,BS04菌株对辣椒疫病菌的拮抗作用较强。
[0036](2)鉴定:将筛选到的抑菌效果较好的BS04菌株进行形态学、生理生化特征和16SrDNA序列测定鉴定。
[0037]形态学观察:将BS04菌株在NA培养基平板上划线接种,28°C培养1-3天,观察菌落特征。菌落初为圆形,边缘整齐,白色不透明,隆起。随着培养时间延长,菌落边缘不整齐,出现褶皱状;菌体为杆状,有芽孢。
[0038]生理生化特征:菌株BS04的生理生化特征见表1。
[0039]表1:BS04菌株的生理生化特征
[0040]
【权利要求】
(BacillussubtilisBS04),其特征在于分离自辣椒根际土壤中,保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),其保藏编号为CCTCCN0:M2014294〇
,其特征在于对辣椒疫病菌、烟草黑胫病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和莴苣灰霉病菌的病原真菌的抑菌应用,对原菌抑菌率在40%-80%之间,对辣椒疫病菌的抑菌率达80%以上。