文档介绍：该【用于蛋白生产-ca2+atp酶过表达的改良的载体和酵母菌株的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【56】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【用于蛋白生产-ca2+atp酶过表达的改良的载体和酵母菌株的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。用于蛋白生产:ca2+atp酶过表达的改良的载体和酵母菌株的制作方法
专利名称:用于蛋白生产:ca2+atp酶过表达的改良的载体和酵母菌株的制作方法
技术领域:
本发明涉及包含一种或多种编码Ca2+ATP酶、内质网凝集素分子伴侣(例如,钙网蛋白(CRT)或钙联接蛋白(CRX)和/或ERp57蛋白)的核酸分子的宿主细胞,和它们用于生产具有减少的O-糖基化的重组糖蛋白的应用。(2)相关领域的描述
糖蛋白介导人和其它哺乳动物中的很多重要功能,包括催化作用、信号传递、细胞一细胞通讯以及分子识别和结合。糖蛋白组成真核生物中的大多数非胞质蛋白(Lis和amron,:1-27(1993))。为治疗目的已经开发了很多糖蛋白,在过去20年中,天然存在的糖蛋白的重组形式已经成为生物技术工业的重要部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白的实例包括促红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAb)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、干扰素-β(IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)5和人绒毛膜促性腺激素(hCH)(Gumming等人,Glycobiology1:115-130(1991))。重组生产的糖蛋白的糖基化模式的变化最近已经成为科学领域的很多关注的话题,作为接近临床的潜在预防剂和治疗剂而生产的重组蛋白。一般而言,糖蛋白的糖基化结构寡糖随用于生产它们的细胞的宿主种类而改变。
在非人宿主细胞中产生的治疗性蛋白可能含有非人糖基化,其可能在人体中引发免疫应
答-例如酵母中的高甘露糖基化(Ballou,:440-470(1990));
植物中的α(1,3)-岩藻糖和β(1,2)-木糖(Cabanes-Macheteau等人,Glycobiology9:365-372(1999));中国仓鼠卵巢细胞中的N-羟乙基神经氨酸(Noguchi等人,:5-62(1995))和小鼠中的Galα-1,3Gal糖基化(Borrebaeck等人,,14:477-479(1993))。因为由非人哺乳动物细胞生产的糖蛋白的寡糖结构倾向于与人糖蛋白的寡糖结构更密切相关,所以大多数商业化的糖蛋白是在哺乳动物细胞中生产。但是,哺乳动物细胞作为蛋白生产的宿主细胞具有一些重要的缺点。除了费用高以外,在哺乳动物细胞中生产蛋白的过程会产生异质性的糖形群体,具有低的体积测定滴度(volumetrictiters),并且需要不断进行的病毒抑制和大量时间来产生稳定的细胞系。直到约2000年,适用于生产具有人样糖基化模式的重组糖蛋白的低等真核生物宿主细胞才成为可能。从那时起,Gerngross在美国专利号7,029,872中公开了制备重组低等真核生物宿主细胞的方法,所述细胞能生产具有人样N-糖基化模式的糖蛋白。因而,现在非常关注使用低等真核生物宿主细胞来生产重组糖蛋白。尽管连接的糖基化的途径已经成为许多分析的主题,但是
0-连接的糖基化的过程和功能仍然未被理解。已知,不同于连接的糖基化,糖基化是一个翻译后事件,其发生在顺式-高尔基体(cis-Golgi)中(Varki,Glycobiol.,3:97-130(1993))。尽管0-连接的糖基化的共有受体序列(象N-连接的糖基化的共有受体序列一样)似乎不存在,但是几种糖蛋白的大量O-连接的糖基化位点周围的氨基酸序列的比较证实在位-1位和+3位的脯氨酸残基的频率比糖基化残基增加,且丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸残基显著增加(Wilson等人,.,275:529-534(1991))。糖蛋白中的丝氨酸和苏氨酸残基段也可能是糖基化的潜在位点。已经证实,酵母-衍生的重组蛋白经常携带与它们的天然对应物相比额外的非天然的聚糖(VandenSteen等人,:151-208,(1998))。这些非天然的聚糖可以产生具有不希望的免疫原性或异常的活性的蛋白。因而,需要开发在具有减少的或没有糖基化的酵母和其它低等真核生物中生产蛋白的方法。Tanner等人在美国专利号5,714,377中描述了酿酒酵母的/W/7和/WU基因以及制备具有减少的0-连接的糖基化的重组蛋白的方法,所述方法使用真菌细胞,所述真菌细胞中的一个或多个/^r基因已经被遗传修饰,从而生产具有减少的连接的糖基化的
重组蛋白。Ng等人在美国公开的专利申请号20020068325中公开了通过使用反义或共抑制或通过酵母宿主菌株的工程化来抑制O-糖基化,所述菌株具有与O-连接的糖基化有关的基因(具体地,一个或多个/厂基因)中的功能突变的缺失。Clausen在美国公开的专利申请号20030186850中公开了GalNAc-β-苄基的用途用于选择性地抑制多肽GalNAc-转移酶的凝集素,且不用作参与聚糖生物合成的其它糖基转移酶的底物,从而抑制O-糖基化。Orchard等人在美国专利号7,105,554中描述了亚苄基噻唑烷二***和它们作为抗霉菌剂的用途,例如,Bobrowicz等人在W02007061631中证实的抗真菌剂可以以对宿主细胞非致死的方式使用,所述宿主细胞用于生产具有减少的O-连接的糖基化的重组蛋白。Konrad等人在美国公开的专利申请号20020U8235中公开了治疗或预防糖尿病的方法,其通过药理学地抑制组织或细胞中的O-连接的蛋白糖基化来进行。Kojima等人在美国专利号5,沈8,364中公开了用于抑制糖基化的治疗组合物,其中使用诸如苄基-α"N-乙酰基半乳糖***等化合物,其会抑制O-糖基化的延伸,导致O-α-GalNAc的积累,以阻断白细胞或肿瘤细胞对SLex或Slea的表达,从而抑制这些细胞与内皮细胞和血小板的粘附。Boime等人在美国专利号6,103,501中公开了激素的变体,其中通过修饰在糖基化位点处的氨基酸序列,改变了O-连接的糖基化。但是,即使考虑上述生产重组宿主细胞
(其生产具有减少的或没有&糖基化的蛋白)的尝试,仍然需要能够生产具有减少的&糖基化的重组蛋白的宿主细胞。
发明内容
发明人已经发现,通过在重组宿主细胞中过表达内源或外源Ca2+ATP酶,可以在重组宿主细胞中实现表达具有减少的&糖基化的重组蛋白。与不过表达Ca2+ATP酶的相同细胞相比,过表达内源或外源Ca2+ATP酶的宿主细胞生产具有减少的O-糖基化的重组蛋白。如在实施例中所证实的,包含编码异源或内源Ca2+ATP酶的表达盒的重组宿主低等真核生物宿主细胞能生产重组蛋白,其中&聚糖占据(occupancy)与不过表达内源或外源Ca2+ATP酶的细胞相比减少了直至4倍。
因而,本发明提供了低等真核宿主细胞,其中编码至少一种内源或外源Ca2+ATP酶的核酸分子被导入宿主细胞中并在其中表达,其中Ca2+ATP酶的表达是异位的。在具体的方面,Ca2+ATP酶由可操作地连接到异源调节序列上的开放读码框编码,所述异源调节序列可以提供Ca2+ATP酶的组成性的或可调节的表达,且可在宿主细胞中工作。在其它方面,低等真核宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。在还另外的方面,所述宿主细胞是***营养酵母,例如巴斯德毕赤酵母O0ZcAia/^1Stori1Sh在具体的方面,所述Ca2+ATP选自巴斯德毕赤酵母
/7MV和拟南芥Ura力ii/oAsisthaiiana)WAY。在其它方面,用重组载体进一步转化本发明的低等真核宿主细胞,所述重组载体包含源自低等真核宿主细胞的调节核苷酸序列和编码要由上述宿主细胞生产的选择的哺乳动物蛋白的编码序列。在某些方面,选择的哺乳动物蛋白是治疗蛋白,且可以是糖蛋白,包括但不限于抗体。在其它实施方案中,所述宿主细胞可以是酵母或丝状真菌宿主细胞,诸如巴斯德毕赤酵母细胞,其中编码至少一种内源或外源Ca2+ATP酶的载体被导入宿主细胞中并在其中表达,且所述宿主细胞另外表达导入宿主细胞中的核酸分子,所述核酸分子包含源自巴斯德毕赤酵母细胞或在其中有功能的调节核苷酸序列,所述核苷酸序列可操作地连接到编码人治疗糖蛋白(诸如抗体)的开放读码框上。还已经发现,在低等真核生物宿主细胞中过表达钙网蛋白和ERp57蛋白也会实现&聚糖占据的减少。因而,也提供了低等真核生物宿主细胞,其包含一种或多种编码钙网蛋白和/或ERp57蛋白的核酸分子,其中所述蛋白被异位表达。在其它实施方案中,所述宿主细胞包括编码至少一种内源或外源Ca2+ATP酶的核酸分子,其中Ca2+ATP酶的表达是异位的。一般而言,低等真核生物宿主细胞另外包括编码重组蛋白的核酸分子,在具体的方面,所述重组蛋白是糖蛋白,在其它方面,所述重组蛋白是抗体或其片段诸如Fc或Fab。在其它实施方案中,将上述宿主细胞中的任一种工程化化,以减少或消除编码蛋白化甘露糖基转移酶
mn蛋白的至少一个内源巴斯德毕赤酵母基因的功能,从而提供与具有功能性/^r基因的宿主细胞相比,能生产具有减少的糖基化的重组蛋白的宿主细胞。在其它方面,所述/Wr蛋白选自:。在其它方面,使所述宿主细胞进一步接触PMT基因表达或PMT蛋白功能的一种或多种抑制剂。在其它实施方案中,减少、删除或破坏编码内源分子伴侣蛋白的基因,并将编码异源分子伴侣蛋白的核酸分子导入所述细胞中。在具体的方面,所述分子伴侣蛋白是PDIl蛋白。在上述宿主细胞的其它方面,所述宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母iPichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母QPichiatrehalophila)、Pichia左oc/afflae、膜醭毕赤酵母(/"icAiamembranaefaciens)^Pichiaminuta(Ogataeaminuta.、Pichialindneri),Pichiaopuntiae、Pichiathermotolerans^柳毕赤酵母QPichiasalictaria)、Pichiaguercuum,皮杰普氏毕赤酵母{Pichiapijperi)、具柄毕赤酵母{PichiastiptisX甲醇毕赤酵母O0ZcAiaeiAa/o/ica)、毕赤酵母属的种G0ZcAiasp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酵母属的种(Saccharomycessp.)、裂殖酵母属^tJftiSchizosacchromycessp.)>^Μ##{Schizosacchromyces
办e)、多形汉逊酵母Qbnsenulapo^TBor/^a)、克鲁维酵母属的种(Z/wj^erofflj^^ssp.)、乳酸克鲁维酵母(,Kluyveromyces^aciis)、白色假丝酵母菌ipmdidaalbicans),I^JH{Aspergillusnidulans),黑曲毒(Aspergillusniger)、米曲M^Aspergillusoryzae),里氏木霉(Trichodermareesei),ChrysosporiumIucknowense^)、廉抱霄iFusariumvenenaturn)^Physcomitrellapatens禾口粗糙链孢霉(Afetfro1^oracrassa).毕赤酵母属的种、酵母属的任意种、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的任意种、曲霉菌属的任意种、里氏木霉、ChiysosporiimIucknowense、镰孢菌属的任意种和粗糙链孢霉。其它实施方案包括生产与不包含本文公开的遗传修饰的重组糖蛋白相比具有减少的糖基化或&聚糖占据的重组蛋白的方法。重组蛋白包括治疗有关的蛋白和糖蛋白,包括抗体和其片段。因而,提供了生产重组蛋白的方法,所述方法包括(a)提供低等真核生物宿主细胞,所述细胞包含编码内源或外源Ca2+ATP酶的核酸分子,其中Ca2+ATP酶在所述宿主细胞中的表达是异位的;(b)将核酸分子导入编码重组蛋白的宿主细胞中;和(C)在适合生产重组蛋白的条件下,培养所述宿主细胞。另外提供了生产重组蛋白的方法,所述方法包括(a)提供低等真核生物宿主细胞,所述细胞包含编码至少一种