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专利名称:用于有机酸生产的改良的酵母菌株的制作方法
用于有机酸生产的改良的酵母菌株本发明涉及用酵母生产有机酸。更具体地,本发明涉及生产有机酸的酵母并涉及通过过量表达一种或多种己糖转运蛋白的酵母生产有机酸的方法。
背景技术:
在食品和药学工业中广泛使用多种有机酸,并且有机酸作为化学工业的新结构单元材料引起越来越多的关注(Werpy,,,USDepartmentofEnergy:OakRidgeTN)。特别地,如果它们通过环境友好的发酵策略产生的话,则它们提供了对石油衍生的并因此是有限的结构单元材料的合理的备选。此类有机酸的例子包括乳酸、柠檬酸、衣康酸和琥珀酸。用于此类方法的微生物包括细菌、丝状真菌和酵母。但是,此类方法具有许多不利之处,特别地导致所需的长发酵期间和由于与高浓度杂质混合的低产物浓度而致的高的酸纯化成本。成本是决定此种方法是否能真正用于结构单元生产的备选的至关重要的因素。因此,人们寻找用微生物提高有机酸生产的生产性(productivity)的方法。增加生产性的一个领域是增强生产菌株的强壮性。例如,具有低pH的培养基对于有机酸的生产是有利的,因为由此产生游离酸而非
阴离子形式,这通常降低纯化成本。但是,此种生产环境对微生物产生了高的应激培养基是酸化的,从而细胞不得不积极地抵销跨质膜的增加的PH梯度。在低的外部pH时,有机酸对细胞产生额外的应激,因为它们通过质膜扩散并酸化胞质。假定有这种应激,通过使用本领域现有技术的话存在生产性的限制,因为微生物细胞最终将丧失生存力和代谢活性。抵销这种效应的一个可能性是分离更强壮的微生物菌株,即,在低pH能够改善生存力和代谢活性的菌株。已提出了用于此类选择或分选策略的方法,例如US20050112737和US20070065899。事实上,用于增加生产性的许多方法依赖于假定生产环境(如酸应激)限制了生产性,如之前所述。用于菌株改进的另一主要关注涉及产物形成率本身,这是从参与产物形成的酶活性被增强的意义上来说的。通常增强的酶活性的例子包括重要的代谢途径如糖酵解,其通常提供用于生产有机酸所需的中间体。但是,即使已知在酵母如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中,糖酵解流调节的一个决定步骤是糖摄取,也就是将糖跨细胞膜转运,从未考虑将该事实用来在微生物中提高有机酸生产的生产性。本发明涉及通过提高己糖摄取来提高微生物的有机酸生产性。已经显示在酿酒酵母()中通过过量表达己糖转运蛋白能够改善CO2和乙醇生产(EP0785275,US6159725,Perez等人,2005,Guillaume等人,2007,和Gutierrez-Lomeli
等人,2008)。但是,从未描述过己糖摄取对用微生物进行有机酸生产的影响。糖摄取可以是微生物生产有机酸、特别是在低pH生产有机酸的限制因子似乎是难以相信的,但是令人吃惊的是,在酵母菌株中过量表达己糖转运蛋白可以如下所述改进其有机酸生产性。在面包酵母中,至今已知20种基因编码类似于葡萄糖(己糖)转运蛋白或与己糖摄取相关的蛋白质(HXT1至HXT17、GAL2、SNF3和RGT2)。已进行了许多不同的研究来确定这些转运蛋白各自的特征(亲和性和能力(capacity))、以及构建缺失了一种或多种HXT基因和不同组合的菌株、和最终构建组合了不同转运蛋白的亲和性和能力的嵌合蛋白。发明概述本发明的一个目的是提供用过量表达至少一种己糖转运蛋白的酵母生产有机酸的方法。相对于不过量表达己糖转运蛋白的酵母菌株,至少一种己糖转运蛋白的过量表达提高了有机酸的生产性。酵母菌株可能表达涉及目的有机酸生产的进一步的基因。在充分的培养基中通过培养过量表达己糖转运蛋白的酵母生产有机酸,从而在培养基中积聚目的有机酸并随后通过本领域已知的技术纯化至所需的程度。此外,我们显示通过己糖转运蛋白过量表达决定的糖酵解流的增加不仅对微生物生产性而且对生物质累积可以具有积极的作用。相比背景酵母,所述现象可以是或多或少明显的。附图简述
图1在酿酒酵母GRF18U菌株中(过量)表达HXTl或HXT7基因。在用葡萄糖
2%(w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。在上方图中,将生长测定为光密度(0D660nm),对于对照(圆圈、虚线)、HXT1转化体(正方形、实线)和HXT7转化体(三角形、实线)。在下方图中,对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗(空心符号)和乙醇生产(实心符号)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。(过量)表达HXTl或HXT7基因。在用葡萄糖2%(w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。在左边,将生长测定为光密度(0D660nm),对于对照(圆圈、虚线),HXT1(正方形、实线)转化体和HXT7(三角形、实线)转化体。在右边,对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗(空心符号)和乙醇生产(实心符号)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图3在酿酒酵母GRF18U(左图)(右图)菌株中(过量)表达HXTl或HXT7基因对于乙醇和生物质累积的影响给出了转化体相对于对照菌株在图1和2中描述的动力学的最大累积/生产计算的生物质累积和乙醇生产的增加(表示为百分率)。(过量)表达HXTl的GRF18ULpLDH转化的酿酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生产(空心符号)。在用葡萄糖5%(w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D660nm),对于对照(圆圈、虚线)和HXTl(正方形、实线)转化体。对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗
(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。
(过量)表达HXT7的GRF18ULpLDH转化的酿酒酵母菌株中的乳酸和乙醇生产(空心符号)。在用葡萄糖5%(w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D660nm),对于对照(圆圈、虚线)和HXT7(三角形、实线)转化体。对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。(过量)(实心符号)。在用葡萄糖5%(w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D660nm),对于对照(圆圈、虚线),HXTl(正方形、实线)转化体。对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。(过量)(实心符号)。在用葡萄糖5%(w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D660nm),对于对照(圆圈、虚线),HXT7(三角形、实线)转化体。对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图
(过量)(实心符号)。在用葡萄糖5%(w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D660nm),对于对照(圆圈、虚线),和HXTl(正方形、实线)转化体。对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。:(过量)(实心符号)。在用葡萄糖5%(w/V)作为碳源的基本(YNB)培养基中的生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D660nm),对于对照(圆圈、虚线),和HXT7(三角形、实线)转化体。对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗(b)、乙醇生产(C)和乳酸生产(d)。数据对应于三个独立克隆独立测试至少两次的平均值。图7:在(过量)表达HXTl或HXT7基因的m850((,pdc-,LpLDHa量表达)菌株中的乳酸生产。、无氨基酸且无(NH4)2SO4YNB、lg/l脲、5g/l乙醇、和以葡萄糖9%(w/V)作为碳源的基本培养基中实施生长动力学。a)将细胞的生长测定为光密度(0D660nm,空心符号),对于对照(圆圈、虚线)、HXTl转化体(正方形、实线)和HXT7转化体(三角形、实线)。对于相应的菌株,测定了葡萄糖消耗(b,空心符号)和乳酸生产
(C,实心符号)。阐述实施方案的描述在一个实施方案中,本发明涉及制备有机酸的方法,;,从而形成有机酸,。本发明因此涉及产生有机酸的方法,通过在包含碳源的培养基中培养过量表达至少一种与己糖摄取相关的基因的酵母菌株来产生有机酸。“在合适的培养基中培养酵母菌株”的另一术语是“培养”酵母菌株。酵母可以在所选择的条件下生长是指例如通过660nm处的光密度测定的生物质的量增加。在另一实施方案中,酵母菌株不在所选择的条件下生长是指生物质不增加,但无论如何产生有机酸。己糖转运活性的提高是指己糖跨过质膜的转运率提高。这可以通过过量表达至少一种己糖转运蛋白而实现。己糖转运蛋白因此是能够转运己糖的蛋白质。总己糖转运蛋白活性的增加能够通过提高同源的己糖转运蛋白基因的表达或通过导入同源的或异源的己糖转运蛋白基因的更多拷贝而实现。己糖转运蛋白活性的提高也可以通过表达或过量表达调节己糖转运活性的基因来实现,优选地所述基因刺激己糖转运活性。应当注意的是,提高己糖转运蛋白的能力而非提高其表达也在本发明的范围内。所生产的有机酸可以选自丙烯酸、乳酸、衣康酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、2,5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、柠檬酸、葡糖二酸、谷氨酸、丙二酸、丙酸、葡糖酸、曲酸、
香豆酸、抗坏血酸、己二酸、乙酰丙酸或任一其它所需要的有机酸。在本发明的一个优选的实施方案中,除了己糖转运蛋白外,酵母菌株还过量表达至少一种与生产有机酸相关的基因。例如,在一个实施方案中,酵母菌株表达己糖转运蛋白和异源的乳酸脱氢酶基因,以使得酵母细胞产生乳酸。酵母菌株可以包含有利于有机酸生产的进一步的遗传修饰。这些可以借助于基因重组技术或随机诱变或本领域已知的其它技术导入。例如,前述的用于生产乳酸的酵母菌株优选地具有降低的***酸脱羧酶活性,甚至更优选的是敲除了任一***酸脱羧酶活性。本发明中使用的用于生产有机酸的酵母菌株可以选自酵母的任一已知的属和种。-vanRij,"TheYeasts,",,,AcademicPress,London,1987所述。在一个实施方案中,酵母的属可以是酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)Jii巴利酵母属(Debaromyces)、拿逊酵母属(Nadsonia)、油脂酵母属(Lipomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、三角酵母属(Trigonopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、隐求(Cryptococcus),^.MM^M(Trichosporon)>^SlgβM(Aureobasidium)>
油脂酵母属(Lipomyces)、法夫酵母属(Phaffia)、红酵母属(Rhodotorula)、耶氏酵母属(Yarrowia)或许旺酵母属(khwarmiomyces)等。优选地,酵母选自酵母属、接合酵母属或克鲁维酵母属。更优选地,酵母是酿酒酵母、拜耳接合酵母()或乳酸克鲁维酵母(.)。在一个特别优选的实施方案中,酵母是酿酒酵母菌株GRF18U、W303IB、BY4742(Eurc^carf登录号Y10000)、-5B(MATa,ura3_52,his3-ll,leu2-3/112,TRP1,MAL2_8c,SUC2)禾口113—1IC(MATa,ura3_52,his3_ll,TRP1,MAL2-8c,SUC2-,InstituteofMicrobiology,JohannWolfgangGoethe-University,Frankfurt,Germany)>(MATapdcl::IoxPpdc5::IoxPpdc6::loxPura3-52)(vanMaris等人,2004)、(Liu和Lievense2005)或者拜耳接合酵母ATCC60483;或者乳酸克鲁维酵母PM6-7A。酵母可以是单倍体或二倍体。在本发明的酵母菌株中欲过量表达的编码己糖转运蛋白基因的编码区可以自任意来源分离。在一个实施方案中,己糖转运蛋白的编码区分离自酿酒酵母。应该指出的是,如果编码区编码基本上同一于自生物体的细胞纯化的相同蛋白质的蛋白质序列,则编码区是自该生物体“分离”的。优选地,将编码己糖转运蛋白的编码区以目的己糖转运蛋白在酵母中产生并基本
上有功能的方式掺入酵母中。此种酵母在文中可以被称为“功能性转化的”。功能性己糖转运蛋白有助于己糖的摄取。换句话说,己糖转运蛋白刺激己糖跨质膜的转运。一旦自生物体的核酸提取出(“分离了”)编码区或通过化学手段合成了编码区,可以将其制备用于转化入酵母并在酵母中表达。最小地,这涉及将编码区插入载体和可操作地连接至在该载体上存在的并在酵母中是有活性的启动子。可以使用任一载体(整合型的、染色体的或游离型的)。可以使用在目的宿主中有活性的任一启动子(同源的或异源的;组成型的、可诱导的或阻抑型的)。此种插入可以涉及使用限制性核酸内切酶来在可操作地连接至启动子是可能的所希望的位点处“打开”载体,然后将编码区连接至所希望的位点。根据需要,在插入载体前,可以制备编码区用于目标生物体。这可以涉及改变在编码区中使用的密码子,以更充分地匹配目标生物体的密码子使用;改变编码区中可能削弱编码区的转录或翻译或者编码区的mRNA转录物稳定性的序列;或者添加或去除编码信号肽的部分(由编码区编码的指导蛋白质至特定的位置(例如细胞器、细胞膜或细胞器膜,或胞外分泌)的蛋白质的区域),以及本领域已知的其它可能的制备等。不管编码区是否被修饰,当编码区插入载体,它可操作地连接至在酵母中有活性的启动子。启动子如所知的那样,是能够指导邻近的编码区转录的