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专利名称:用于烟草imp分子标记的引物的制作方法
技术领域:
本发明属生物技术和基因工程领域,涉及一种基于微型反向重复转座元件(Miniatureinverted-repeattransposableelement)的分子标记技术。具体为用于烟草IMP分子标记的引物。
背景技术:
普通烟草(Nicotianatabacum)属于茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)植物,是一种重要的经济作物。尽管烟草在生物技术和基因工程领域作为转基因模式植物发挥重要作用,但其自身的遗传研究相对落后,至今还未建成一张高密度、覆盖整个基因组的遗传图谱,严重限制了对烟草重要农艺性状的遗传基础和遗传规律的研究。针对烟草染色体多、基因组大,加之遗传背景狭窄的事实,常规分子标记手段如SSR,RAPD不能高效稳定检测栽培烟草不同品种间遗传多态性。迫切需要利用一种高效、可靠的分子标记技术,开发稳定性高、均勻分布基因组的分子标记。IMP(Inter-MITEPolymorphism)即微型反向重复转座元件间多态性,是一种基于聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR),扩增相邻两MITEs间序列长度多态性的分子标记技术。微型反向重复转座元件(miniatureinverted-repeattransposableelements,MITEs)
是一类广泛分布于动植物基因组中的DNA转座元件,其特征是(1)序列长度不超过600个核苷酸碱基;(2)序列5’和3’端具有11个核苷酸碱基的末端反向重复(TerminalInvertedRepeat,TIR)和多以TAA或TA为靶标位点重复(TargetSiteDuplication,TSD)的序列结构;(3)这类DNA转座元件拷贝数较高并偏好插入到基因编码区。利用末端反向重复和靶标位点重复序列来进行引物选择,已经在豆类和大麦等作物上得到很好应用(,102:773-781)。但在烟草上还未见应用的报道。同时,在烟草全基因组查找MITE并利用其进行分子标记的开发还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,提供一种用于烟草IMP分子标记的引物。本发明解决其技术问题的手段是通过利用美国烟草基因组测序计划释放的基因组序列,采用生物信息学手段,获得一批烟草MITE序列。然后根据IMP标记策略,进行烟草IMP标记开发和应用研究,得到一批用于烟草IMP分子标记的引物。本发明中,所述用于烟草IMP分子标记的引物分别具有SEQIDNO:1至SEQIDNO10所示的序列。本发明的有益效果是本发明是一种烟草新生物分子标记技术,提供的这些引物可用于烟草IMP分子标记。而这些标记可以利用的领域主要包括(1)烟草分子标记辅助选择育种。也就是用于烟草品种的选育;
(2)烟草遗传图谱的构建;(3)烟草重要功能基因的定位和发现;(4)烟草特定性状早期诊断、早期筛选;(5)烟草亲缘关系判断(如烟草品种混杂、烟草与及其野生种的分析等)。
具体实施例方式本发明中,有关烟草IMP分子标记引物的完成步骤如下第一步烟草基因组数据获得对美国烟草基因组测序计划释放的原始序列进行去冗余、拼接整理,获得查找MITE的原始数据;第二步烟草候选MITE查找根据MITE的结构特征末端反向重复(TIR)和靶标位点重复(TSD),利用生物信息学方法获取烟草候选MITE序列;第三步基于MITE的引物选择依据上一步获得的候选MITE序列,将其具有相同TIR结构MITE序列划为一个子集,并对这个子集中的序列进行多序列联配,找到MITE结构中保守结构域,以此为核心选择1820个核苷酸长度的引物,例如本发明核苷酸或氨基酸序列表中的SEQIDN0:1至SEQIDNO10所示的引物序列。第四步多聚酶链式反应(PCR)将上步选择的引物,在烤烟品种HicksBroadLeaf上测试,考察各条单引物的最适PCR反应条件,并对不同引物进行两两组合,优化PCR反应条件;第五步PCR扩增及其遗传多态性统计依照上步成功扩增的IMP单引物及其有效组合引物对,在8个烟草主栽品种红花大金元、K326、HicksBroadLeaf、Florida301、Samsun、Burley21、TN86和土耳其巴斯玛进行PCR扩增,PCR扩增产物经变性
PAGE胶分离、银染,统计品种间的多态性条带。最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然,本发明不限于以上实施例子,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种用于烟草IMP分子标记的引物,其特征在于,该引物具有SEQIDNO1所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDNO:2所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDNO:3所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDN0:4所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDNO:5所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDNO:6所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDNO:7所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDNO:8所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDNO:9所示的序列。
,其特征在于,该引物具有SEQIDN0:10所示的序列。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域,旨在提供一种用于烟草IMP分子标记的引物。该引物具有SEQIDNO1至SEQIDNO10所示的核苷酸序列。本发明是一种烟草新生物分子标记技术,提供的这些引物可用于烟草IMP分子标记。而这些标记可以利用的领域主要包括(1)烟草分子标记辅助选择育种。也就是用于烟草品种的选育;(2)烟草遗传图谱的构建;(3)烟草重要功能基因的定位和发现;(4)烟草特定性状早期诊断、早期筛选;(5)烟草亲缘关系判断(如烟草品种混杂、烟草与及其野生种的分析等)。