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用于植物中可靠基因表达的调节核酸分子的制作方法
本发明提供用于通过减小植物的群体中表达的变异系数和/或非表达或低表达的植物的数目,来在转基因植物中增强表达的可靠性的方法和手段。
【专利说明】用于植物中可靠基因表达的调节核酸分子
[0001]发明概述
[0002]转基因的有效表达不仅仅取决于最佳的一组启动子和终止子。在某百分比的事件中,转基因转录沉默。在极端情况下,例如在转基因谷物中,至多50%来自具体转基因的事件可以在连续世代中沉默(Vain等,1998)。已研究了几种方法来防止对转基因的此负面影响。
[0003]支架/基质附着区(S/MAR)已在实验上定义为可以在体外测定中附着于分离的真核细胞核基质的DNA元件。S/MAR长度至少为300bp,但通常超过1000bp的长度。大多数S/MAR具有65%至超过90%的A/T含量,但具有很小的序列保守性。它们已作为定义DNA结构域的元件涉及(Boulikas,1995;Bode,1995)。可能的作用方式可以是,它们使顺式调节元件(例如启动子和增强子)附着于核基质,其中它们变得使基质结合的转录因子易接近(Cockerill等,1987;Bode等2000)。已报道,通过在转基因的上游和下游放置S/MAR,可能通过阻断整合位点的抑制性位置效应而使基因表达可以得到增强
(Lorence等,2004;Allen等,2005)。虽然存在S/MAR对植物中的转基因表达具有正面影响的一些报道(Butaye等,2004;0h等,2005;Torney等,2004;Xue等,2005),但存在关于它们对降低事件之间的变异的影响的冲突证据(Liu和Tabe,1998;Schoffel等1993;VanderGreest和Hall,1994;Mlynarova等,1995;Vain等,1999;DeBolle等,2007;Li等,2008)。
[0004]直到今天,S/MAR仍高度难以捉摸,不能通过生物信息学手段可靠地鉴定,对相关效应蛋白质知之甚少(DeBolle等,2007)。它们的长度及它们必须处于转基因的两侧限制了它们在商业植物转化载体中的有用性。此外,高A/T含量使遗传操作的常规方法变得困难。根据S/MAR调节的环模型,它们通常在几千碱基对上对基因表达施加影响。
[0005]绝缘子是已报道为防止周围染色质对转基因表达的位置效应的另一种类型的DNA边界元件。它们的作用方式的解释在能够阻断增强子/启动子相互作用的单个染色质结构域的形成和防止异染色质散布入邻近区域之间变化(Kuhn和Geyer,2003;Gaszner和Felsenfeld,2006)。
[0006]研究最充分的来自动物的绝缘子是来自果蚬属(Drosophila)的gypsy和scs/scs'绝缘子(Barolo等,2000;Markenstein等,2008)及来自鸡的β-球蛋白HS4绝缘子等(Wang等,2009)。在植物中异源表达动物绝缘子来减少对转基因的位置效应,产生更可靠的基因表达已取得了一些成功
(Nagaya等,2001;She等,2010)。但是,如果共表达gypsy绝缘子的异源绝缘子结合蛋白,则可以更强烈地减小变异系数(~5倍而不是~3倍)(She等,2010)。迄今尚未鉴定出有效的植物绝缘子。这部分是由于未能在已知的绝缘子元件之间发现序列相似性的事实(Sultana等,2011)。
[0007]在希望可靠表达的序列上游和下游都包含绝缘子的必要性及共表达异源结合蛋白的需要限制了用于商业植物转化的灵活性。
[0008]一些作者还指出了绝缘子和S/MAR二者之间可能的联系:已报道了脊椎动物中的绝缘子结合蛋白CTCF和果蝇属中的绝缘子结合蛋白Su(Hw)至少部分处于核基质中(Byrd和Corces,2003;Dunn等,2003;Yusufzai和Felsenfeld,2004)。[0009]已报道了内含子在动物及多种单子叶植物(例如Callis等,1987;Vasil等,1989;Bruce等,1990;Lu等,2008)和双子叶植物(例如Chung等,2006;Kim等,2006;Rose等,2008)中增加基因表达,也称为内含子介导的增强(IME)。但是,本发明描述内含子或衍生自内含子或包含在内含子中的核酸分子对基因表达的可靠性的新影响。可靠的基因表达可以定义为衍生自一种1^嫩构建体转化的转基因植物的群体中低百分比的非表达者。由此得出结论,可以减少必要事件的绝对数目,因为分离出显示适宜的表达的植物的可能性更高。可靠的基因表达的另一定义是转基因植物的群体中表达的变异系数减小。因此,本发明具有显著减少商业植物转化所需的时间和成本的能力。
[0010]发明详述
[0011]本发明的第一实施方案包括用于在植物群体,优选独立植物群体,例如独立的初级转化体植物群体中减小表达的变异系数的方法,其包括步骤
[0012]a)提供包含至少一个选自以下的可靠性增强核酸(RENA)分子的重组核酸构建体
[0013]i)具有SEQIDNO:1至16或94至116666的任一个中定义的序列的核酸分子,或
[0014]ii)具有与SEQIDNO:1至16或94至116666所定义的序列中的任一个具有80%或更高同一性的序列的核酸分子,优选地,该同一性是85%或更高,更优选地,该同一性是90%或更高,甚至更优选地,该同一性是95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高或99%或更高,在最优选的实施方案中,该同一性是与SEQIDNO:1至16或94至116666所定义的序列中的任一个100%同一,或
[0015]iii)i)或ii)的核酸分子的100或更多个连续碱基、优选150或更多个连续碱基、更优选200个连续碱基或更多、甚至更优选250或更多个连续碱基的片段,或
[0016]iv)100个核苷酸或更多、150个核苷酸或更多、200个核苷酸或更多、或250个核苷酸或更多的核酸分子,其在等同于在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、°C杂交,在2XSSC、%SDS中50°C或65°C,优选65°C洗涤的条件下,与包含SEQIDNO:I至16或94至116666所述的转录增强核苷酸序列或其互补序列的至少50个、优选至少100个、更优选至少150个、甚至更优选至少200个、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。优选地,该核酸分子在等同于在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、°C杂交,在IXSSC、%SDS中50°C或65°C,优选65°C洗涤的条件下,与包含SEQIDNO:1至16或94至116666所述的转录增强核苷酸序列或其互补序列的至少50个、优选至少100个、更优选至少150个、甚至更优选至少200个、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交,更优选地,该核酸分子在等同于在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、°C杂交,在0,1XSSC、%SDS中50°C或65°C,优选65°C洗涤的条件下,与包含SEQIDNO:1至16或94至116666定义的序列中的任一个所描述的转录增强核苷酸序列的至少50个、优选至少100个、更优选至少150个、甚至更优选至少200个、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交,或
[0017]V)与之前在i)至vi)下提到的核酸分子的任一个互补或反向互补的核酸分子,
[0018]b)使i)至V)下定义的RENA分子与启动子和/或目的核酸分子功能性连接,其中至少该启动子对该RENA分子中的至少一个而言是异源的,和
[0019]c)使该与启动子和/或目的核酸分子功能性连接的RENA分子整合入植物细胞、植物或其部分的基因组,和[0020]d)从步骤c)中产生的转基因植物细胞、植物或其部分再生植物,优选独立的初级转化体植物,
[0021]其中ii)至V)下定义的分子使表达的变异性降低至对应的具有SEQIDNO:1至16或94至116666的序列的核酸分子的至少10%;优选至少20%,例如30%;更优选至少40%,例如50%;甚至更优选60%、70%或80%;甚至更优选至少90%或95%;最优选100%,且
[0022]其中与在其基因组中包含不含有i)至V)中定义的各RENA分子的各重组核酸构建体的各群体相比,该植物群体显示目的核酸分子的表达的变异系数低至少10%;优选至少20%,例如30%;更优选至少40%,例如50%;甚至更优选60%、70%或80%;甚至更优选至少90%或95%;最优选100%。
[0023]优选地,包含含有RENA分子的重组构建体的植物的群体和各对照植物群体是独立的初级转化体植物的群体。
[0024]优选地,该RENA分子对与它功能性连接的启动子和目的核酸二者而言是异源的。
[0025]变异系数定义为植物群体,例如初级转化体植物群体内目的核酸表达的标准差除以各植物群体中各目的核酸的表达的平均值。
[0026]可靠的基因表达定义为衍生自一种T-DNA转化的转基因植物的群体中低百分比的非表达者或低表达者,该T-DNA包含含有至少一个与启动子和目的核酸功能性连接的RENA分子的表达构建体,其中至少该启动子对该RENA分子而言是异源的。
[0027]由此得出结论,可以减少必要事件的绝对数目,因为得到适宜的表达的可能性更闻。
[0028]术语“整合入基因组”将理解为核酸分子稳定整合入生物的基因组,使得该核酸分子可以在各生物的多种后续世代中遗传。
[0029]术语“群体”将理解为培养在相似,优选相同的条件下的优选属于相同属的多个生物,优选植物。该群体的单个生物可以在多种时间点,优选在相同时间点培养。
[0030]术语“独立的初级转化体”将理解为在一个或多个转化实验中再生的衍生自不同转化事件的生物,优选植物。因此,从每个转化事件仅再生一株植物。因此,独立的转化体植物的群体中的生物不是基因型克隆,而是各衍生自不同的转化事件。
[0031]从衍生自按照本发明的方法产生的植物或群体的第二、第三或任意其他世代的初级转化体植物衍生的植物群体也显示变异系数减小和
/或低表达植物或非表达植物的数目减少。因此,本发明的方法还可以用于在随后的世代中减少低表达或非表达植物的数目,从而在n+1代中降低群体中低表达植物或沉默植物的数目。
[0032]与包含相当的表达构建体,优选除不含重组RENA分子之外相同的重组表达构建体的初级转化体植物的群体相比,显示与RENA分子功能性连接的目的核酸分子的表达的变异系数减小的初级转化体植物的群体具有优势,因为显示减小的变异系数的群体中非表达或低表达植物的数目减少。从而可以减少为了分离至少一株显示希望的表达水平的植物而需要在转化方法中再生的植物的数目。植物转化和再生是非常费力的方法,尤其是如果涉及难以转化和/或再生的植物物种或种质。因此,需要再生数目减少的Tl植物的转化方法具有很高的价值。
[0033]本领域技术人员知道用于使单向启动子变为双向启动子的方法,及用启动子序列的互补序列或反向互补序列来产生具有与原序列相同的启动子特异性的启动子的方法。例如,Xie等(2001)“BidirectionalizationOfpolarpromotersinplants,,naturebiotechnologyl9,677-679页针对组成型以及诱导型启动子描述了这类方法。作者描述,在任意给定启动子的5’端加上最小启动子足以获得以相同的特性
(如启动子特异性和强度)在两个方向上控制表达的启动子。因此,上述与RENA功能性连接的启动子在互补序列或反向互补序列中具有功能,因此RENA在互补序列或反向互补序列中也具有功能。
[0034]一般而言,RENA可以与任意启动子功能性连接,如组织特异性启动子、诱导型启动子、发育特异性启动子或组成型启动子。各RENA将导致与该至少一个RENA功能性连接的各启动子控制下的异源核酸表达的可靠性增强。
[0035]优选地,该一个或多个RENA与任意异源启动子功能性连接,并将增强该启动子控制下的核酸分子的表达的可靠性。将用于本发明的任意方法的组成型启动子可以衍生自植物,例如单子叶或双子叶植物,衍生自细菌和/或病毒,或者可以是合成启动子。将使用的组成型启动子是例如来自香芹()的PcUbi启动子(W02003102198)、来自玉米(Zeamaize)的ZmUbi启动子、来自编码的***水解酶I的拟南芥()基因At3g44310的AtNit启动子、来自玄参花叶病毒的34S启动子、来自烟草花叶病毒的35S启动子、来自土壤杆菌属(Agrobacteria)的nos和ocs启动子、ScBV启动子(US5994123)、SUPER启动子(Lee等2007,.)、来自编码铁氧还蛋白NADH还原酶的拟南芥基因At5g66190的AtFNR启动子、来自(Pisumsativum)的ptxA启动子(W02005085450)、来自编码磷酸丙糖易位蛋白的拟南芥基因