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用于检测hpv核酸的材料和方法
提供了能够与HPV16和/或HPV18核酸,特别是编码E2和E6-7基因产物的mRNA杂交的核酸。此类核酸可用于从生物学样品分离RNA的方法、用于检测生物学样品中特定RNA剪接形式变体的存在的方法和手段、用于测定生物学样品中RNA比率的相对比率的方法和手段、用于预测癌前宫颈损伤进展的方法和手段、和用于检测基因或基因表达破坏的方法和手段。
【专利说明】用于检测HPV核酸的材料和方法
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002],,118的优先权,其在此都通过提及完整并入。
[0003]发明背景
[0004]
[0005]本公开内容涉及用于测定样品中核酸存在的方法、组合物和试剂盒,所述核酸包括源自人乳头瘤病毒(HPV)的核酸。
[0006]
[0007]人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的最重要原因,其中13类引起HPV相关宫颈疾病和癌症。使用分子测试针对致癌性
HPVDNA的筛选已经可用于诊断HPV相关疾病。然而,目前的测试方法不能精确预测哪些感染可以形成癌症,因为大多数HPV感染是短暂的,并且自发消退和清除。因此,探索其它生物标志物以在反射测定法(reflexassay)中使用以确认哪些感染会进展并且需要进一步治疗。
[0008]疾病进展可以与某些HPV基因的表达相关。因此,HPVmRNA的检测可以是重度感染的别的生物标志物。开发用于诊断学的一些HPVmRNA测定法检测单一类型的转录物种类,诸如E6或E7致癌性序列。这些测定法不能预测重度感染,因为单一种类的丰度可以变动,这是由于在疾病过程期间发生的复杂表达样式,或由于免疫应答对HPV的降解所致。另外,mRNA靶物在收集后可能降解·,或者收集标本中的感染细胞数据可能较低,这两者可以影响测定结果。作为一种解决办法,设计用于同时检测一定比率的两种mRNA种类的HPV测定法可以比检测单一mRNA种类的测定法更能预测疾病。
[0009]另外,HPVDNA通常以每个细胞50-100个拷贝以环状附加体状态以生产性感染维持。在此状态中,HPV癌基因E6和E7的转录受到E2蛋白紧密控制。E6和E7分别靶向p53和pRb,并且如此干扰正常的细胞周期。消除此转录控制的细胞由于其加速再进入细胞周期中而比其它细胞具有增殖优势。
[0010]破坏或删除E2基因(如经常在病毒整合入宿主基因组中期间发生的
)消除对E6和E7的负反馈,活化端粒末端转移酶,并脱阻抑hTERT表达,并且如此明显促成细胞永生化的进展及最终癌症进展。
[0011]已经利用特定核酸序列和序列变化的检测和表征来检测指示感染的病毒或细菌核酸序列的存在、与疾病和癌症有关的哺乳动物基因的变体或等位基因的存在、和法庭样品中及亲子关系测定中找到的核酸来源的鉴定。牵涉正常生物学过程的RNA种类的表征对于了解各种了解很少的生物学过程可以是重要的。
[0012]RNA(例如信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、小核RNA、和其它RNA)的检测和表征在许多领域中是一种重要的工具,所述领域包括分子生物学、毒理学和生物化学。信使RNA(mRNA)是一种必需的功能性细胞组分;在基因表达过程期间,mRNA的功能性单链结构被合成,并且充当在蛋白质合成中用于翻译过程的中间模板。mRNA分子的短暂存在以DNA转录成RNA分子开始,并且最终以降解结束。在其寿命期间,mRNA分子在翻译前也可以加工,编辑,并转运。剪接是修饰前mRNA以除去称作内含子的非编码序列的某些区段的过程;保留的区段可以包含蛋白质编码序列,并且称作外显子。有时,可以以几种不同方式剪接前mRNA信息,容许单一转录物编码多种蛋白质。
[0013]信使RNA(mRNA)的检测在诊断学中是重要的,因为它可以提供
DNA检测不能提供的病毒载量和基因表达信息。这些因素经常给出关于疾病进展和预后的线索。目前用于mRNA检测的技术呈现许多问题,包括复杂性和污染潜力。
[0014]最常见的mRNA检测方法包括Northern印迹、核糖核酸酶保护测定法(RPA)和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。然而,这些中每种技术虽然在灵敏性上提供一些优点,但是需要时间和材料要求。另外,一些技术需要扩增靶mRNA,因为总mRNA仅占总RNA的约1%,并且任何特定的mRNA是小得相当多的百分比。
[0015]目前,逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)广泛用于表征RNA转录物。然而,所述方法具有下列限制:1)仅可以共扩增有限数目的特定区;2)突变或可变剪接可以限制特异性引物检测RNA的能力;及3)难以以连续模式方法表征mRNA结构。
[0016]因此,具有能够测定给定核酸在样品中存在或缺乏的材料和方法会是有用的。另外,具有能够测定基因(包括HPVE2基因)是否受到破坏、删除、或以其它方式不在宿主细胞中表达的材料和方法会是有用的。
[0017]发明概述
[0018]本公开内容提供了可用于检测样品中的特定核酸及测定那些核酸是否完整或受到破坏的核酸和方法。
[0019]在一个方面,提供了分离的核酸,其具有不超过200
个核苷酸的总体长度且包含至少一种与选自下组的核苷酸序列具有至少75%同源性的核苷酸序列、基本上由所述至少一种核苷酸序列组成或由所述至少一种核苷酸序列组成:SEQIDNO:1至SEQIDNO:105和SEQIDNO:111至SEQIDNO:308、其RNA等同物及其互补物。
[0020]在一个方面,提供了一种检测靶RNA存在的方法,该方法包括:a)提供至少一种DNA捕捉探针,其中所述至少一种DNA捕捉探针与支持物结合;b)使所述祀RNA与所述至少一种DNA捕捉探针杂交,生成靶RNA:DNA捕捉探针复合物;c)分离所述靶RNA:DNA捕捉探针复合物;d)提供至少一种DNA放大探针,并使所述至少一种DNA放大探针与所述靶RNA:DNA捕捉探针复合物杂交,生成靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物;e)提供抗RNA:DNA杂合物抗体,并将所述靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物与所述抗体一起温育,生成靶RNA:DNA:抗体复合物;f)检出所述抗体,其中所述检出指示所述靶RNA的存在。在一个方面,抗体与可检测标志物缀合,并且检测步骤包括检测标志物。在一个方面,可检测标志物选自下组:碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。在一个方面,检测步骤包括提供结合所述抗RNA:DNA杂合物抗体的第二抗体,其中所述第二抗体与可检测标志物缀合,且其中所述检测进一步包括检测标志物。在一个方面,支持物包含磁珠。在一个方面,磁珠与至少一种链霉抗生物素蛋白分子缀合,并且至少一种
DNA捕捉探针与生物素分子缀合。在一个方面,至少一种捕捉探针和/或放大探针是核酸探针,如上文所列的。
[0021]在一个方面,至少一种DNA捕捉探针和至少一种DNA放大探针的长度是约15至约200个碱基。
[0022]在一个方面,靶RNA是剪接变体,并且选择至少一种DNA捕捉探针和至少一种DNA放大探针以检测所述剪接变体的存在。
[0023]在一个方面,至少一种DNA捕捉探针和至少一种DNA放大探针与来自HPV高风险型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,26,66,73和82的RNA互补。
[0024]在另一个方面,提供了用于检测靶RNA的试剂盒,该试剂盒包含:a)至少一种DNA捕捉探针,其与磁性支持物结合山)至少一种DNA放大探针;c)抗RNA:DNA杂合物抗体;和
d)检测试剂。在一个方面,所述抗RNA:DNA杂合物抗体与可检测标志物缀合,并且所述检测试剂包含所述可检测标志物的底物。在一个方面,试剂盒进一步包含结合所述抗RNA:DNA杂合物抗体的二抗,其中所述二抗与可检测标志物缀合,且其中所述检测试剂包含所述可检测标志物的底物。
[0025]本公开内容提供了提供靶RNA进行检测的方法,该方法包括:将含有靶RNA的生物学样品与羧基珠一起温育;将珠分离;裂解附着于分离珠的生物学样品;并从裂解的生物学样品分离珠,其中所得的上清液含有用于检测的靶
RNA。
[0026]在另一个方面,公开了用于核酸检测的方法,其不依赖于靶物扩增。通过特异性核酸寡核苷酸捕捉感兴趣的核酸。如下提供信号放大,即添加覆盖捕捉的RNA靶物的DNA探针(或者靶物是DNA,反之亦然),然后使用能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体检测。此杂合物捕捉测定法随转录物的量和长度增加而给出信号的线性升高。因此,它可以用于测量现有技术不能测量的删除。通过测定靶核酸破坏的程度,与来自完整的参照核酸组的总体信号相比,能够测定靶物是否受到破坏及靶物受到破坏的程度。
[0027]在一个方面,通过将样品至少分成第一和第二部分测定对靶物的破坏。在足以生成两组DNA:RNA杂合物的条件下处理样品的第一部分:一组包含靶核酸,而一组包含至少一种参照核酸。然后,在足以生成包含参照核酸的DNA:RNA杂合物组,而非包含靶核酸的组的条件下处理样品的第二部分。然后,比较样品的第一部分中DNA:RNA杂合物的总量与样品的第二部分中DNA:RNA杂合物的总量。若靶核酸是缺少的,则在样品的第一和第二部分中应当有相同量的DNA:RNA杂合物。还呈现了用于测定破坏(若有的话)程度的方法变化,其通过应用多个对靶核酸的实质性部分特异性的探针,并逐渐除去探针进行。在检出DNA:RNA杂合物变化前可以除去的探针越多,靶核酸受到破坏的程度越大。
[0028]在另一个方面,提供了测定E2基因、cDNA或mRNA是否缺乏或破坏的方法。可以应用此类方法以测定E2基因是否在表达,HPV基因组是否整合入宿主细胞基因组中等等,从而评估HPV感染的进展和/或测定HPV感染进展成癌症的风险。
[0029]附图简述
[0030]为了进一步理解本公开内容的性质、目的和优点,应当参照以下详细描述,其与以下图结合阅读,其中类似的参照数字表示类似的要素。
[0031]图1是通过生物素化的DNA探针(白色柱形)捕获的靶RNA(用交叉排线画出阴影的柱形)的示意图。“B”代表生物素模块;“SA”代表链霉抗生物素蛋白模块;“AP”代表与抗体缀合的碱性磷酸酶,但是AP可以是任何其它合适的可检测模块(例如辣根过氧化物酶等),并且B和SA可以通过其它连接模块替换。
[0032]图2的图描绘了使用DNA捕捉探针(白色柱形)、多种DNA放大探针(黑色柱形)和多种DNA:RNA杂合物抗体来“放大”信号,而不需要扩增靶RNA(用交叉排线画出阴影的柱形)。“B”代表生物素模块;“SA”代表链霉抗生物素蛋白模块,B和SA可以用其它缀合技术替换,其中DNA探针与珠缀合;“AP”代表与抗体缀合的碱性磷酸酶,但是AP可以是任何其它合适的可检测模块
(例如辣根过氧化物酶等)。
[0033]图3是通过与基片⑶结合的不同DNA捕捉探针捕获的靶RNA(虚线箭)的图。还显示了非缀合的DNA放大探针(黑色柱形)和多种检测并结合DNA:RNA杂合物区的抗体(与碱性磷酸酶或任何其它合适的可检测模块,诸如辣根过氧化物酶等等缀合)。基片(例如珠)可以携带多种DNA捕捉探针,并且DNA捕捉探针可以是相同的(即相同序列和/或长度)或不同的(即不同序列和/或不同长度)。
[0034]图4提供了实验结果,其显示了在RNA捕获后添加未生物素化的DNA探针的效果。在此实验中,将可变数目的生物素化探针与链霉抗生物素蛋白珠缀合。靶物是HPV16的E6/7基因转录物。在添加(黑色柱形)和未添加(白色柱形)未标记的信号放大探针(一步对两步测定法)的情况中用每组珠实施测定法。在不添加信号放大步骤(白色柱形)时,信号随由捕捉探针提供的覆盖量而升高。然而,在添加信号放大探针(黑色柱形)时,信号比不添加它们时大,并且它们用较少(3-5)捕捉探针实现较高的信号。
[0035]图5显示了内源杂合物经常是临床背景噪音的来源。“RLU”=相对发光单元。
[0036]图6显示了在测定PreservCyt?溶液中的细胞样品时裂解缓冲液(其中ιοο%缓冲液含有约3Μ硫***酸胍和约2%去污剂)浓度对测定法背景的影响,并且证明临床背景随裂解缓冲液浓度降低而降低。
[0037]图7显示了细胞团粒的低渗裂解确保背景噪音保持较低且稳定,并且无论使用的标本量如何,背景不显著改变。“PC”=PreservCyt?溶液;“pc(-)”=没有hpv革巴物的
PreservCyt?溶液中固定的标本(宫颈刮落)集合。
[0038]图8显示了自HPV阳性细胞(SiHa)的HPVE6/E7检测限。这显示了使用本公开内容的方法,需要少到1x103个细胞检测HPVE6/7RNA。
[0039]图9显示了来自对各种裂解缓冲液测试裂解由C00H珠捕获的细胞的能力的结果。图9的数据及下文表1的数据显示优选的裂解缓冲液是约1M硫***%去污剂。
[0040]图10显示了随时间的经羧酸盐修饰的(C00H)磁珠(SeraDyn产品目录编号6515-2105-050350)的细胞捕获,其证明在温育30分钟后已经捕获约95%的细胞。
[0041]图11显示了C00H珠捕获与低渗裂解的比较,并且指示C00H珠捕获比低渗裂解在从细胞获得mRNA方面更有效。“PC-”指示缺乏HPV存在的宫颈刮落标本的集合。
[0042]图12的图描绘了捕捉和信号放大探针设计区。可以通过捕获到具有捕捉特定靶物的特异性捕捉寡聚物的磁珠上“表征”HPV转录物的长度,并用延长杂合物区长度使用的多组未标记的寡核苷酸检测。若捕捉RNA携带与使用的捕捉探针互补的序列,则信号会产生。信号输出会在连续添加扩增信号探针的情况下增加,直到达到最大长度,在那里信号会达到稳定水平。显示了