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专利名称:用于产生可测序文库的改进的核酸处理的系统和方法
技术领域:
本发明涉及分子生物学和核酸测序仪领域。更具体地说,本发明涉及使用产生适用于测序的片段文库的方法和独特的衔接子元件(adaptorelement)有效处理核酸。
背景技术:
分子生物学领域一直有多种进展,使得能够开发出多种深入了解生物机制性质的技术。这些技术中某些的能力极大地影响科学发现,具有极好的未来前景。重要的是,这些技术中的某些彼此补充,可协同地用于加速科学研究获得对生物系统认识的速率。应该了解,分子生物学领域极为复杂,所述技术的开发者们可发现先前已知机理的新用途,但相同开发者会以通过分子生物学领域进展获得新的发现和对生物机制的新认识作为基础。例如,本领域已知有多种“核酸测序”技术,它们对科学认识产生了巨大贡献,对科学发现以及诊断应用具有极好的未来开发前景。旧式核酸测序技术包括本领域一般技术人员所共知的称为Sanger型测序法的方法,其采用终止及大小分离技术来鉴定核酸组成。最近开发的测序技术包括诸如被称为杂交测序(SBH)或通过连接技术测序等种类的技术。另一类有效测序技术包括被称为
“合成测序”(SBS)的技术,并包括被称为“焦磷酸测序(Pyrosequencing)”的技术。通常采用SBS技术测定核酸样品中一种或多种分子的身份或核酸组成。SBS技术提供多个优于先前所用测序技术的所需优点。例如,SBS实施方案能够进行被称为高通量测序的技术,该技术相对于先前技术以低费用产生大量高质量序列信息。此外的优点包括以大规模并行方式从多个模板分子同时产生序列信息。换言之,在单次处理中同时测定来源于一个或多个样品的多种核酸分子的序列。典型的SBS实施方案包括逐步合成多核苷酸分子链,每一链与来自基本相同的模板核酸分子群的链互补。例如,SBS技术通常如下操作将单个核苷酸(亦被称为核苷酸物质(species)或核酸物质)加到群体中的各个新生多核苷酸分子上,其中添加的核苷酸物质在特定序列位置与对应模板分子的核苷酸物质互补。对于所述群体在同一序列位置上,核酸物质加到新生分子通常并行地进行,并用本领域已知的多种方法检测,所述方法包括但不限于被称为焦磷酸测序的方法或荧光检测方法,焦磷酸测序检测释放自掺入事件(incorporationevent)的焦磷酸分子,荧光检测方法例如采用可逆或“模拟(virtual)”终止子的荧光检测技术(本文所用术语模拟终止子通常是指大大减慢反应动力学的终止子,其中可采用诸如移走反应物等另外的步骤来终止反应)。通常,重复SBS过程直到合成与模板互补的完全序列长度
(即出现靶核酸分子的全部序列位置)或所需序列长度。在某些SBS实施方案中,为了从每一个掺入的核酸物质产生可检测信号,发生多种酶反应。在焦磷酸测序实例中,采用可被称为酶级联的上述SBS方法,其中级联中的各种酶物质发挥作用以修饰或利用来自前一步骤的产物。例如,如本领域一般技术人员所理解,当将各种核苷酸物质掺入到新生链时,将有无机焦磷酸(亦被称为PPi)分子释放到反应环境中。反应环境中存在ATP硫酸化酶,其将PPi转化为ATP,进而由荧光素酶催化以释放光子。一般技术人员亦了解,在级联中可使用另外的酶,以提高暴露到不同核苷酸物质时的信号辨别力以及检测信号的总能力。在该实例中,某些实施方案可采用多种酶,包括但不限于以下酶中的一种或多种腺苷三磷酸双磷酸酶,其降解未掺入的核苷酸物质和ATP;核酸外切酶,其降解线性核酸分子;焦磷酸酶(亦被称为PPi-酶),其降解PPi;或抑制其它酶活性的酶。改进信号辨别力的酶的另外实例阐述于以下文献中2008年6月27日提交的美国专利申请顺序号12/215,455,其标题为“SystemandMethodForAdaptiveReagentControlinNucleicAcidSequencing(用于核酸测序中的适应性试剂控制的系统和方法)”;和2009年1月29日提交的代理人案号21465-538001US,其标题为“SystemandMethodforlmprovedSignalDetectioninNucleicAcidSequencing(
用于改进核酸测序的信号检测的系统和方法)”,其各自为所有目的以其整体在此引作参考。另外,用使与制备和/或测序方法有关的一个或多个步骤或操作自动化的仪器来实施某些SBS实施方案。某些仪器采用诸如具有孔的板或其它类型的微反应器构造等元件,它们提供同时在各个孔或微反应器中进行反应的能力。SBS技术以及用于大量并行测序的系统和方法的另外的实例阐述于以下文献中美国专利第6,274,320号、第6,258,568号、第6,210,891号、第7,211,390号、第7,244,559号、第7,264,929号、第7,323,305号和第7,335,762号,其各自为所有目的以其整体在此引作参考;和美国专利申请顺序号11/195,254,为所有目的以其整体在此引作参考。亦已对分子生物学产生很大影响并在某种程度上可与核酸测序协同使用的另外的技术,包括通常被称为“核酸探针阵列”(通常亦被称为“微阵列”)的领域。如本领域技术人员通常所了解,微阵列技术使得可选择性鉴定和/或富集被靶向的核酸分子。业已在很多不同情形下采用微阵列,提供多个生物研究领域的丰富信息,以及取得了巨大的商业价值。由微阵列技术提供的主要优点之一是以大规模并行方式用被靶向的探针询问选择(interrogateselect)核酸分子的能力,其中某些单个微阵列实施方案可包括数十万种“探针特征(probefeature)”,每一种探针特征包含数十万靶向特异性核酸序
列的探针。微阵列能力的一个实例包括用于从复杂样品选择性“富集”或“复杂性减少(complexityreduction)”靶核酸分子群的方法。这些方法的优点包括以大规模并行方式(其中关于各个靶分子的特异性特点可能存在问题)靶向选择分子,所述优点可包括鉴定每一分子的特定序列组成。因此,微阵列技术可与高通量测序技术协同使用以选择性富集目的靶分子群,并随后有效鉴定各靶分子的序列组成。在该实例中,单个微阵列可通过与微阵列上的互补探针杂交从样品捕获数万或数十万核酸分子。随后可从微阵列洗脱被捕获的核酸分子,对每一个进行处理及测序。此外,在使用探针的某些复杂性减少实施方案中,不必使用固相基底,并且可广泛地理解为使用溶液相探针选择性富集目的靶分子的“杂交介导的”复杂性减少。另外的实例参见2007年4月24日提交的美国专利申请顺序号11/789,135,其标题为“Useofmicroarraysforgenomicrepresentationselection(用于基因组呈提选择的微阵列的用途)”;和2008年1月8日提交的11/970,949,其标题为"ENRICHMENTANDSEQUENCEANALYSISOFGENOMICREGIONS(基因组区域的富集及序列分析)”,它们为所有目的以其整体在此引作参考。为了提高科学家们深入了解生物疑难问题的能力,通常期需不断改进诸如上述微阵列和测序技术等技术。在优选实施方案中,所述改进的目标为降低费用、提高通量及效率
以及提高数据质量,所述提高数据质量包括但不限于提高灵敏度和特异性。因此,明显有利的是,不断开发应用分子生物学领域的知识以及了解的微阵列和核酸测序技术,以提供更有效和更有力的发现工具。本文所述本发明各个方面以新颖及创造性方式采用若干分子生物学概念,以提高处理样品的效率,所述效率为降低费用、减少步骤和提高数据质量。发明简述本发明实施方案涉及测定核酸序列。更具体地说,本发明实施方案涉及用于纠正通过SBS测定核酸序列期间获得的数据中的错误的方法和系统。阐述了用于有效处理靶标的衔接子元件实施方案,其包括半互补双链核酸衔接子,所述衔接子包含非互补区和互补区,其中非互补区包含第一扩增引物位点和第二扩增引物位点,互补区包含测序引物位点和一个或多个肌苷物质(inosinespecies)。还在一个实施方案中阐述了包含衔接子元件实施方案的试剂盒。另外,阐述了用于有效靶标处理的方法的实施方案,所述实施方案包括将双链核酸衔接子物质与线性双链核酸分子的每一末端连接,以产生衔接的双链核酸分子,其中双链核酸衔接子物质包含适用于连接到线性双链核酸分子的互补区和抑制连接的非互补区;解离已衔接的双链核酸分子以产生第一链和第二链,每条链在第一末端包含第一扩增引物位点和测序引物位点,在第二末端包含第二扩增位点;以及单独扩增第一链和第二链,以产
生包含第一链拷贝的第一克隆群和包含第二链拷贝的第二克隆群。在某些实施方案中,互补区包含一个或多个肌苷物质。本发明还阐述用于多元靶标处理(multiplextargetprocessing)和富集的方法的实施方案,所述实施方案包括将双链核酸衔接子物质与来自多个样品的多个线性双链核酸分子的每一末端连接,以产生衔接的双链核酸分子库(pool),其中双链核酸衔接子物质包含样品特异性标识元件(identifierelement);解离来自已衔接的双链核酸分子库的多个成员,以从各个解离成员产生第一链和第二链,从而产生单链分子群;使多个单链分子群成员与已结合基底的捕获探针杂交,其中单链分子群包含至少一个不与已结合基底的捕获探针杂交的成员;从已结合基底的捕获探针洗脱已杂交的成员,产生富集的单链分子群;扩增多个富集的单链分子群成员,以由各个扩增成员产生克隆群;单独测定克隆群序列,以产生各个扩增成员的序列数据,所述数据包括多元标识元件(multiplexidentifierelement)的序列组成;以及用样品特异性标识物将序列数据与样品之一相联系。因此,在第一方面,本发明涉及用于有效靶标处理的衔接子元件,其包含包含非互补区和互补区的半互补双链核酸衔接子,其中非互补区包含第一扩增引物位点和第二扩增引物位点,互补区包含测序引物位点和一个或多个肌苷物质。在一个实施方案中,非互补区包含可检测部分,例如荧光标记。所述标记可选自
Cy3,Cy5、羧基荧光素(FAM)、Alexafluor、罗丹明绿、德克萨斯红、R-藻红蛋白和半导体纳米晶体。在另一与一个上述实施方案相容的实施方案中,互补区包含平末端,其可与靶核酸的平末端连接。在另一与上述第一个实施方案相容的实施方案中,互补区包含粘性末端,其为单碱基突出端(可为T核苷酸物质)或包含多个碱基。在再一与上述实施方案相容的实施方案中,互补区包含多元标识元件,其优选包含11个序列位置,最优选选自SEQIDNOI-SEQIDNO133。亦优选多元标识元件包含使得能检测至多两个测序错误并纠正测序错误之一的设计。在又一与上述实施方案相容的实施方案中,肌苷物质位于单链中。例如,所述肌苷物质位于离链末端至少四个序列位置处。此外,举例而言,所述肌苷物质中的至少两个彼此之间不能相距少于四个序列位置。在又一与上述实施方案相容的实施方案中,互补区包含一个或多个硫代磷酸酯物质。另外,非互补区还可包含一个或多个硫代磷酸酯物质。优选硫代磷酸酯物质位于互补区和非互补区的末端区域。所有硫代磷酸酯物质能够保护末端区不受核酸外切酶消化。在第二方面,本发明还提供包括上述半互补双链核酸衔接子元件的试剂盒。在第三方面,本发明涉及用于有效靶标处理的方法,所述方法包括以下步骤让双链核酸衔接子物质与线性双链核酸分子的每一末端连接,产生衔接的双链核酸分子,其中双链核酸衔接子物质包含适用于连接到线性双链核酸分子的互补区和抑制连
接的非互补区;解离已衔接的双链核酸分子以产生第一链和第二链,每条链在第一末端包含第一扩增引物位点和测序引物位点,在第二末端包含第二扩增位点;以及单独扩增所述第一链和第二链,以产生包含第一链拷贝的第一克隆群和包含第二链拷贝的第二克隆群。在一个实施方案中,所述方法可另外包括测定第一克隆群序列以产生第一链序列组成的步骤。此外,所述方法可包括让序列组成与原始样品相联系的步骤,其中序列组成包含来自多元标识元件的序列,所述多元标识元件包含包括在双链核酸衔接子中的优选的11个序列位置。在特定实施方案中,多元标识元件选自SEQIDNOI-SEQIDNO133。此外,所述联系步骤可包括检测来自多元标识元件序列中的至多两个错误并纠正至多一个测序错误。在另一与上述实施方案相容的实施方案中,所述方法还包括在解离步骤之前测定已衔接的双链核酸的量的步骤,其中双链核酸衔接子包含荧光部分。荧光部分可响应激发光而发射光,并由检测仪测量,其中所测量的发射光水平与荧光部分的量相关。优选荧光部分可选自Cy3、Cy5、羧基荧光素(FAM)、Alexafluor、罗丹明绿、德克萨斯红、R-藻红蛋白和半导体纳米晶体。在另一与上述实施方案相容的实施方案中,互补区包含一个或多个肌苷物质,其可位于单链中,优选可位于离链末端至少6个序列位置处。例如,所述肌苷物质中的至少两
个彼此之间不能相距少于四个序列位置。有利的是,肌苷物质抑制第一链与第二链形成发夹结构。还有利的是,肌苷物质提高第一链和第二链的扩增效率。在第四方面,本发明还涉及用于多元靶标处理和富集的方法,所述方法包括以下步骤将双链核酸衔接子物质与来自多个样品的多个线性双链核酸分子的每一末端连接,以产生衔接的双链核酸分子库,其中双链核酸衔接子物质包含样品特异性标识元件;解离来自已衔接的双链核酸分子库的多个成员,以从各个解离成员产生第一链和第二链,从而产生单链分子群;使多个单链分子群成员与已结合基底的捕获探针杂交,其中单链分子群包含至少一个不与已结合基底的捕获探针杂交的成员;从已结合基底的捕获探针洗脱已杂交的成员,产生富集的单链分子群;扩增多个富集的单链分子群成员,以由各个扩增成员产生克隆群;单独测定克隆群的序列,以产生各个扩增成员的序列数据,所述数据包含多元标识元件的序列组成;以及用样品特异性标识物将序列数据与样品之一相联系。附图简述当联合考虑附图时,可从以下详述中更清楚地了解以上及另外的特征。在附图中,相似的参考数字表明相似的结构、元件或方法步骤,参考数字最左边的数字表明参考元件在其中首先出现的图的编号(例如,元件130首先出现在
图1中)。然而,所有这些规定意欲为代表性或阐述性,而非限制。图