文档介绍：生物工程大实验基因工程实验内容
《生物工程大实验》基因工程
生物工程大实验项目一览表
《生物工程大实验》基因工程教案
实验一 PCR技术扩增产淀粉酶的细菌16SrDNA序列
一、实验目的和内容
扩增细菌16SrDNA序列方法
掌握PCR基本操作技术,以及琼脂糖凝胶电泳技术内容:1)细菌基因组DNA的提取 2)16S rDNA 序列pcr扩增 3)琼脂糖凝胶电泳
二、实验原理
1985年美国Cetus公司的Kary Mullis等人设计并研究成功的一种体外核酸扩增技术(polymerase chain reaction PCR),这是一种类似于DNA的天然复制过程,以待增的DNA为模板,在体外由
引物介导的酶促合成特异DN***段的方
法。将目的基因DNA在高温(94℃)下
解链成为单链模板;人工合成的一对与
目的基因两侧序列相互补的寡聚核苷酸
引物在低温(30-60℃)下分别与变性的
目的的基因片段两侧的两条链的部分序
列互补结合;在中等温度(65-75℃)下
由耐热DNA聚合酶(Taq酶)将dNTP中
的脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端,
并以此为起点,沿着模板以5’→ 3’
方向延伸,合成一条新的互补链。新合
成的DNA链的起点是加入的引物在模板
DNA链两端的退火位点决定的。
图2-1-1PCR的原理
由于PCR反应中,双链DNA高温变
性成单链,引物与模板单链DNA低温退
火(配对)适温下引物延伸三个步骤反
复循环,每一循环所形成的DNA分子均能成为下一循环的模板,所以PCR的特定靶DNA产物以指数方式递增,在数小时内,经过30个循环后,理论上可使DNA扩增至109倍。原来对单拷贝基因进行探测和分析时需用10ul基因组DNA,现在可以减少到n***平。
1、设汁和选择高效而特异性强的引物是PCR成败关键。
引物(primer)是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的的寡核苷酸(单链DN***段)。引物包括引物1和引物2两种。引物1是5’端与正义链互补的寡核菅酸,用于扩增编码链或mRNA链;引物2是3’端与反义链互补的寡核苷酸,用于扩增DNA模板涟或反密码链。当两段引物与变性双链DNA的两条单链DNA模板退火后,两引物的5’端}iJ]决定了扩增产物的两个末端位置,而扩增的片段长度等于两个引物间的序列片
段长度。引物的长度大约为20-30个寡核苷酸,一般可以用DNA合成仪合成。根据统计学计算,长约17个碱基的寡核营酸序列在人的基因组DNA(3×109bp)中可能出现的概率为1次,因此只要引物不少于16个孩苷酸,即能保证PCR扩增的序列特异性。如果引物过短,会产生非特异性结合,而过长会造成浪费。
计引物的原则:
①引物应是DNA序列的一段高度保守区,即与引物结合的靶DNA序列片段必须是已知的,与两个引物结合的两个片段之问的靶DNA序列则未必清楚。
②引物3’端的保守性很重要,尽量要求使用非简并性密码或简并性较低的密码,如尽量不要选择具有六个密码子的氨基酸。每条引物内部应避免具有明显的二级结构(发夹结构)。所谓发夹结构是指发夹柄至少含有4个碱基配对,而发夹环至少有3个碱基,这种结构尤其避免在引物的3’端出现。如
3’—GATCTGATGC A T G G
5’—CTAGACTACG C C A
③尽可能选择碱基随机分布的序列,即避免具有多聚嘌呤、多聚嘧碇或其他异常序列。引物中G+C碱基含量以40一60%为佳。
④两个引物之间不应有互补序列,尤其是在引物的3’末端的互补碱基。.不能多于5个,否则会引起“引物间二聚体,一旦形成二聚体,则引物序列就不能很好地与模板结合,从而妨碍PCR扩增。
⑤根据实验需要可以在引物的5’端引入适当限制酶切位点,以便
PCR产物的亚克隆即进入载体分子中。此外在限制酶切位点的5’前面还要添加限制酶的保护碱基2—4个。
如一16SRDNA基因的两端序列为:5’-CA GTT ATG CGC AAA TTT AAT AAA ------------AGC GCC GGC GTT CAA TAA TCG-3’
上游引物:5’-AGTTATGCGCAAATT-3’ 24 base GC=50% (BamHI)
下游引物:5’GG-3’ 25 base GC=% (HindIII)
(SalI)
此外设计的引物还有简并引物和嵌套引物
简并引物是一类由多种寡核苷酸组成的混合物,彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。如果PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氮基酸顺序推测而来,就需要合成简并引物(见附录)。如