文档介绍：真菌DNA提取及扩增方法
一真菌DNA提取方法
取已纯化的真菌菌丝。采用改良***化苄法提取DNA。具体方法如下:
(1), 离心管中加入500 μL DNA提取液,先振荡使之充分混匀。
(2)10%SDS100 μL和300μL ***化卞,剧烈振荡,涡旋混匀,使管内混合物成乳状。
(3)于56℃水浴保温1h,每隔10min振荡混匀一次。
(4)加入3M醋酸钠()300μL,冰浴15min12000rpm,4℃离心15min。
(5)收集上清液(约600μL,记住收集的上清液的体积),放入另一新离心管中,再加入等体积的***仿:异戊醇(V:V=24:1)剧烈振荡使之充分混匀,并形成悬乳状。12000rpm,4℃离心15min。
(6)如上5操作再抽提一次,移至另一新离心管中。
(7)加入两倍体积的冷无水乙醇,上下转动混匀,放入-20℃冰箱过夜,使DNA沉淀。
(8)12000rpm,4℃离心15min,收集沉淀。
(9)沉淀用1000μL75%冷乙醇洗涤 5min,重复两次,然后弃去冷乙醇。
(10)真空干燥,将DNA溶于50μLTE缓冲液或ddH2O中,4℃冰箱保存备用。
二真菌的PCR扩增
以提取的基因组DNA为模板,用真菌通用引物ITS4(5′-GCTTATTGATATGC- 3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3′)对真菌rDNA的ITS区域利进行PCR扩增。
PCR反应体系(25)μL:PCR Buffer maxture ;10mmol/L dNTP 1μL;引物ITS4/ITS5(10μmol/L)各1μL;模板DNA 2μL;5U/μL ;ddH2O 。PCR反应程序:95℃预变性4min,94℃变性30s,53℃复性30s,72℃延伸40s,进行35个循环,最后72℃延伸7min,用无菌水代替模板作阴性对照,PCR产物-20℃保存。
细菌和古菌
酶法小量DNA提取
(或直接用竹签挑取纯菌落)于EP管中,加1×TE480ul,稀释成20mg/ml 的溶菌酶20μL,放入37℃摇床2—3小时;
%SDS 50μL 及蛋白酶pK 5μL震荡混匀1分钟, 放入55℃摇床(或烘箱)30-60分钟〔pK浓度为20ug/mL〕;
μL 苯酚:***仿:乙戊醇(25:24:1)取下层, 震荡混匀,12000rpm离心10分钟, 吸取上清液(不要吸到中间渣滓,重复抽提2次);
μL 3mol/L乙酸钠(PH -)混匀后加500 μL异丙醇,放入-20℃冰箱1-2小时或过夜;或者加800ul无水乙醇,加80μL 3mol/L
乙酸钠(PH
-)室温放置10分钟以上;
rpm 离心10分钟,去除上清液,加200μL 70% 乙醇,轻摇洗盐1—2次,
12000 rpm低温离心 5分钟,弃乙醇;
6.(37-55)℃干燥后加1×TE 50μL溶解DNA(视DNA量而定), -20℃保存备用。注意干燥时间不宜过长,一般20-30min,时间