真菌DNA提取方法.doc

文档介绍：真菌DNA提取方法
一、SDS法
基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后,加入高浓度的KAc,0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质,最后用乙醇或异丙醇沉淀。
1、试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl 100mmol/L()
EDTA 50mmol/L ()
NaCl 500 mmol/L
灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/L KAc
(4) RNaseA 10mg/ml
(5) 异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
2、仪器
离心机, 恒温水浴, 台式高速离心机,电泳装置
3、实验程序
(1)、离心菌体,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
(2)、向管中加入50μL20%SDS溶液,混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂,65℃保温10min,并不时摇动。
(3)、加入150μL 5mol/L KAc,混匀,置冰上20-30 min。
(4)、 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,,混匀,-20℃沉淀30 min 。
(5)、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
(6)、加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min,除去RNA。
(7)、 C:I抽提后,加2V乙醇,-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
(8)、用400μL 70%乙醇洗一次后,吹干,加入适量的灭菌ddH2 O或TE溶解DNA。
(9)、电泳检测完整性。
二、lysed cells directly by phenol
(一)、试剂:
1、STE Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH )
2、TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH )
(二)、实验程序
1、。离心菌体
2、400 μl STE Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH )洗2遍 3、8000g for 2 min
4、The pellets were resuspended in 200 ll TE buffer (10 mMTris-HCl, 1 mM
EDTA, pH ) 5、50 mg of 425–600 μm size-fractionated glass beads (Sigma) were added to the cell suspension. 6、100 μl Tris-saturated phenol (pH ) was added to these tubes, followed by a vortex-mixing step of 120–200 s to lyse cells.
7、13 000g for