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专利名称:芽孢杆菌属细菌和杀虫蛋白质的制作方法
技术领域:
本发明涉及消除虫害有效的苏云金芽孢杆菌新菌株,由该菌株产生的晶状蛋白质包含体,包含所说的包含体的杀虫蛋白质,和编码这一蛋白质的基因。此外,本发明还涉及昆虫消除剂和消除昆虫的方法。
背景技术:
与化学合成杀虫剂相比,微生物杀虫剂对天然环境影响小,而且被认为是化学合成杀虫剂的一种有效的替代品。事实上,从19世纪60年代早期起,含有作为有效成分的苏云金芽孢杆菌菌体细胞(下文称作″Bt菌″)或由这些细菌产生的晶状包含体(下文称作″CIs″)的微生物杀虫剂(下文称作″Bt剂″)已被用来防治鳞翅目的各种昆虫。
Bt菌是革兰氏-阳性菌,在孢子形成期细胞中产生CIs(;微生物评论,53,242,1989)。昆虫摄食一定的它们敏感的CIs后,几个小时内将终止摄食并死去。由于CIs的这种作用对昆虫是特异性的,Bt剂对其它动物与植物没有毒性,因此被认为是十分安全的杀虫剂。
包含CIs的杀虫蛋白质由Bt菌的质粒或基因组DNA中编码的基因的转录和翻译产生。迄今为止,已分离了一百种以上编码杀虫蛋白质的基因,但是已经知道所说的编码蛋白质的杀虫活性不同,是它们的氨基酸序列的函数
(,应用微生物进展,42,1,1996)。因此认为,具有新的杀虫活性的Bt菌株具有新的杀虫蛋白质基因。
苏云金芽孢杆菌血清变型KurstakiHD-1(下文称作″HD-1″)(害虫和植物病害的微生物防治,1970-1980,,学院出版社,-44,1981)是市售Bt剂中最常用的Bt菌株。
包含作为有效成分的HD-1的Bt剂已经在消除对合成农业化学品已产生显著抗性的鳞翅目小昆虫(如小菜蛾)方面有效。然而,最近报道了小菜蛾田间菌株的检测结果,发现其已产生了对HD-1的抗性,这在害虫防治中形成一个严重的问题。
此外,归类为鳞翅目的夜蛾科斜纹夜蛾大昆虫,由于对合成杀虫剂灵敏度低,防治起来困难,而且它们可以对植物造成毁坏性的破坏。事实上,没有这类昆虫(如夜蛾科的斜纹夜蛾)能通过常规的Bt剂有效地防治,开发有效的Bt剂是合乎需要的。
夜蛾科的昆虫,特别是Spodopterasp对Bt剂极端不灵敏有以下可能的原因(1)Spodopterasp没有任何可以结合到CIs中杀虫蛋白质上的受体(ShuichiroInagaki,SeibutsutoKagaku,30,74,1992)(2)CIs中的蛋白质被消化,吸收,或者在Spodoptera的消化液中失活,使所说的蛋白质不可能达到靶受体。
同样,已经需要开发对夜蛾科昆虫具有杀虫活性的新CIs。
大多数由天然环境分离的Bt菌对鳞翅目昆虫或任何其它昆虫没有杀虫活性。极少数菌株显示出防治目标昆虫的实用的杀虫活性,可能是因为Bt菌产生的CIs通过以下过程杀死所说的昆虫(1)昆虫摄食CIs,(2)CIs在消化道中溶解产生前***(杀虫蛋白质),(3)前***通过酶活化为***(加工过程),(4)活化的***(所加工的杀虫蛋白质)结合在昆虫的中肠(mid-gut)细胞的受体上,形成微孔,和(5)昆虫的中肠细胞分解。
消化道环境因昆虫不同各异,并与昆虫的膳食密切相关。因此,只有当昆虫将它们和其它食物一起摄入时,CIs失活或活化成为杀虫的,不同昆虫也不同,因此相信,只有步骤(1)到(5)在昆虫中肠完成,CIs才对该昆虫具有杀虫活性。
另一方面,已知孢子(在Bt菌的生活史中的一个阶段)具有对CIs的杀虫活性的显著协同作用。(苏云金芽孢杆菌的分析化学,,1990)曾报道由于孢子的存在,两种CIs的杀虫活性被反转。(应用环境微生物61,2086,1995)曾报道仅摄食Bt菌产生的CIs的昆虫比摄食CIs和孢子混合物的昆虫易变得更有抗性。这些报道表明由Bt菌产生的两个组分,即CIs和孢子,在与昆虫相互作用中密切相关。因此,研究者正专心研究孢子在昆虫中抑制对Bt剂抗性的发展中的作用。
发明概要本发明发明人现已成功地分离了一种Bt菌株,其可有效防治广谱昆虫。这一菌株在防治昆虫(包括夜蛾科家族的昆虫)上非常有效。
而且,本发明发明人已发现所说的Bt菌株产生的CIs与菌株HD-1产生的CIs相比,在碱性条件(pH9至10)下具有更大的可溶性和稳定性;单是CIs即对斜纹夜蛾和小菜蛾具有高水平的杀虫活性;CIs和孢子组合比单纯的CIs对斜纹夜蛾具有更高的杀虫活性;而且加溶的(solubilized)CIs和孢子共存时,杀虫活性可以再现。
此外,本发明发明人已确定了这一Bt菌株产生的杀虫蛋白质的氨基酸序列,并且分离了编码这一氨基酸序列的基因。
因此,本发明的一个目的是,提供不仅对鳞翅目昆虫而且对其它昆虫具有杀虫活性Bt菌。本发明的另一个目的是,提供由所说的Bt菌产生的杀虫蛋白质、编码所说蛋白质的基因、具有所说基因的载体、以及具有所说基因的宿主。
本发明的另一个目的是提供能产生杀虫蛋白质的转化的植物、消除虫害的药剂和消除虫害的方法。
按照本发明的新菌株是菌株SSK-10,其以保藏号PERMBP-6162保藏在工业科学技术机构的国立生物科学和人体技术研究所。这一菌株被分类为苏云金芽孢杆菌。
按照本发明的杀虫蛋白质具有以下氨基酸序列,(a)SEQIDNO2
的氨基酸序列,或(b)SEQIDNO2的氨基酸序列,其具有杀虫活性,其中在SEQIDNO2中的一个或多个氨基酸被取代或被缺失,或者一个或多个氨基酸被添加或被插入到SEQIDNO2的氨基酸序列中。微生物的保藏按照本发明的新菌株SSK-10已于1996年11月12日保藏在工业科学技术机构的国立生物科学和人体技术研究所(1-3Higashi1-Chome,Tsukubacity,Ibaraki,日本),保藏号为FERMBP-6162。
附图简要描述
图1说明按照本发明的杀虫蛋白质的基因的转录分析的结果。有RT利用有RT的反应溶液。没有RT利用没有RT的反应溶液。
发明详述微生物SSK-10菌株是从Sakado市Saitama县的家庭尘埃中分离的。其特征在表1中显示。
表1菌落特性典型的Bt菌大菌落,有一个无色的表面。生长期细胞形态典型的Bt菌。形态特性可变的杆菌(~×~)。革兰氏染色阳性。孢子形态椭圆。观察不到由孢子造成的孢子囊显著膨胀。鞭毛的血清型分类为H7(或者血清变型aizawai)*细胞内含物大的双金字塔形晶状蛋白质包含体(SDS-PAGE测得分子量大约130kDa)。杀虫蛋白质分类为Cry9n。同源性研究显示即使与同源性最大的Cry9Cal(应用环境微生物,62,p80,1996)也仅有71%的同源性。需氧/厌氧特性兼性厌氧细菌。生化特性过氧化氢酶反应阳性卵磷脂酶反应
阳性VP反应阳性*,无脊椎动物病理学杂志,15,139-140,1978进行。
有关本发明新菌株产生的CIs和孢子的非常特别的特性更具体地解释如下。
(应用环境微生物,62,564,1996)曾报道CryI杀虫蛋白质的特征,已知CryIC对夜蛾科的noctuids特别有效,但是对小夜蛾的昆虫,它的杀虫活性大约仅是HD-1菌株产生的CryIA(a)的杀虫活性1/10。而且,包含CryIC和CryIA的Bt菌,正如日本公开专利出版物509235/1993所揭示的,其杀虫活性比HD-1菌株的杀虫活性对Spodopterafruqiperda而言高三倍,对小夜蛾而言高两到数倍。相对而言,由菌株SSK-10的细胞产生的CIs比由菌株HD-1的细胞产生的CIs,对斜纹夜蛾的杀虫活性至少高30倍,对小夜蛾的杀虫活性至少高五倍。在碱性条件下(pH9~10),菌株SSK-10的CIs比菌株HD-1的CIs有更特异的溶解性和更高的稳定性。
此外,菌株SSK-10的杀虫蛋白质基因碱基序列的同源性检索(GenBank,EMBL,DDBJ,PDB序列)显示与已知Bt杀虫蛋白质基因的小的同源性。即使是与同源性最高的Cry9Cal相比,在氨基酸水平仅发现71%的同源性(,应用环境微生物,62,80,1996)。Bt杀虫蛋白质以分子量为
130kd~140kd的前***产生,然后在昆虫中肠中消化成60kd~70kd的***。事实上,已知这一***有杀虫活性,前***的C-末端位点是不需要的(,微生物回顾,53,242,1989)。这样,在有限的氨基酸序列(即对杀虫活性所需的从N-末端位点的第1个到第700个氨基酸)上进行同源性检索(GenBankCDS翻译物,PDB,SwissProt,PIR)。观察到所说的杀虫蛋白质基因与同源性最高的Cry9Cal只有60%的同源性,清楚地表明这一基因是一个新基因。
这些研究结果表明菌株SSK-10是一种新菌株,产生一种新的CI。
此外,杀虫活性由将菌株SSK-10细胞产生的孢子与CIs组合得到提高,杀虫活性由组合自身没有任何杀虫活性的加溶的CIs(下文称作SCIs)与所说的孢子得到恢复。而且发现,这些作用可以以与普通培养中相同的孢子/CIs比,达到相当可观的程度。因此,利用CIs(或SCIs)和本发明新菌株SSK-10产生的孢子,可提供一种虫害防治的高效Bt剂。
本发明的SSK-10菌株的细胞可在普通条件下培养。例如,利用包含碳源(如葡萄糖)和氮源(如大豆粉)的培养基,在20到40摄氏度间的一适当培养温度下,可进行培养。培养优选地在需氧条件下进行,同时通气搅拌1至4天。杀虫蛋白质及其基因本发明提供了由菌株SSK-10的细胞产生的杀虫蛋白质。
按照本发明的杀虫蛋白质具有SEQIDNO2的氨基酸序列。此外,按照本发明的杀虫蛋白质可以具有SEQIDNO2的氨基酸序列,其具有杀虫活性,其中一个或多个(例如一个到几个)氨基酸添加或者插入到SEQIDNO2的氨基酸序列中,或者SEQIDNO2中的一个或多个(例如一个到几个)氨基酸被取代或缺失。应当清楚,通过参考SEQIDNO2的序列,本领域技术人员可以添加,插入,取代或缺失SEQIDNO2的氨基酸序列中的氨基酸而没有任何特殊的困难。
在本发明中,术语“具有杀虫活性的蛋白质”指本领域技术人员评估为杀虫的蛋白质;例如,在与试验实施例1~3和5~7相同的条件下进行的实验中评估为杀虫的蛋白质。
如实施例所示,按照本发明杀虫蛋白质对鳞翅目,鞘翅目和/或双翅目具有杀虫活性。尤其对分类为鳞翅目夜蛾科的斜纹夜蛾和小菜蛾具有高的杀虫活性。
分类为鳞翅目的昆虫例子包括斜纹夜蛾(Spodopteralitura),甜菜夜蛾(Spodopteraexigua),甘蓝夜蛾(Mamestabrassicae),小菜蛾(Plutellaxylostella),美国白蛾(Hyphantriacunea),褐带卷蛾的种(Adoxophyessp.),Autographanigrisigna,及小菜粉蝶(Pierisrapae)。
分类为鞘翅目的昆虫例子包括Anomalacuprea,日本弧丽金龟
(Popilliajaponica),Lissorhoptrusoryzophilus,及Aulacophorafemoralis。
分类为双翅目的昆虫例子包括埃及伊蚊(Aedeaaegypti)和尖音库蚊(CulexPipiens)。
按照本发明杀虫蛋白质可以是晶状蛋白质包含体形式的。这种形式的蛋白质可以通过在微生物中(尤其是在转化的大肠杆菌中)表达本发明的杀虫蛋白质获得,或通过培养本发明新菌株SSK-10的细胞获得。在大肠杆菌中表达的方法将在下文阐述。
按照本发明杀虫蛋白质可以是加溶(solubilized)晶状蛋白质包含体形式的。这种形式的蛋白质可以通过在碱性溶剂中溶解本发明的蛋白质获得。
本发明提供了编码本发明的杀虫蛋白质的核苷酸序列。这一核苷酸序列的典型序列具有SEQIDNO1的全部或部分DNA序列。
当给出本发明的杀虫蛋白质的氨基酸序列时,也就容易确定编码这一蛋白质的核苷酸序列,可以选择编码SEQIDNO2的氨基酸序列的各种核苷酸序列。因此,编码按照本发明的杀虫蛋白质的核苷酸序列包括,作为SEQIDNO1的DNA序列的遗传密码简并结果的DNA序列,相对应于所说DNA序列的RNA序列。
本发明的核苷酸序列可以是天然衍生物,采用部分天然序列全合成或半合成的。
编码本发明的杀虫蛋白质的基因可以从菌株SSK-10中分离,例如,按以下方法首先,从菌株SSK-10的细胞中抽提DNA,用适当的限制性酶切割,然后用噬菌体载体或质粒载体构建包含菌株SSK-10的DNA的文库。从SEQIDNO1的核苷酸序列合成适当的引物,然后以来自SSK-10的DAN为模板进行PCR,扩增所说基因的DN***段。以所说的DN***段作为探针来筛选文库以分离所说基因的全长DNA。
或者,可以通过制备本发明的杀虫蛋白质的抗体,然后利用这一抗体筛选基因组文库或者cDNA文库来分离所说的基因。
此外,可以通过以来自菌株SSK-10的DNA为模板合成编码本发明的杀虫蛋白质的基因的开放读框的5’末端和3’末端引物,并利用它们进行PCR扩增来分离新基因全长DNA。
也可以用遗传工程领域的常规方法,经筛选染色体文库或cDNA文库来获得所说基因的全长DNA;例如,利用基于部分氨基酸序列构建的适当DNA探针。
突变可以引入到基因中,例如,通过利用市售的诱变试剂盒,或者利用包含突变的引物进行PGR(“PCR及其应用”,编者YoshiyukiSakakibara等,Yodosha,pp63-67,1990)。
本发明提供了一种载体,在该载体中本发明的核苷酸序列以这样的方式存在在宿主细胞中其可复制,该核苷酸序列编码的蛋白质可以表达。