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专利名称:新的具有杀虫活性的细菌蛋白质的制作方法
新的具有杀虫活性的细菌蛋白质发明领域
本发明涉及害虫控制、特别是昆虫控制领域,提供了编码命名为ISLP蛋白质的杀虫蛋白质其毒性片段或变体的重组DNA序列,其有效用于保护生物体不受害虫损伤,如保护植物不被昆虫损伤。还提供了含有编码本发明的ISLP蛋白质的核酸分子的植物,及使用这些核酸序列来减少害虫如昆虫对于植物的危害的方法和手段。
背景技术:
使用细菌生物杀虫剂如苏云金芽孢杆菌(5fl"7/附幼wW"g/e附/s,Bt)是农业及其他领域(即疾病载体)用于昆虫控制的可行选择,这将会以经济上可持续和环境上友好的方式增加作物产量。Bt的Cry蛋白质是高度特异性的,对于人类、脊推动物和植物无害,并且是可完全生物降解的,所以不会在环境中累积残留的毒性产物(Schnepf等,1998)。迄今为止超过200种c/j基因序列已经被确定并分类成44个家族和不同的亚类(Crickmore等,1998,2005)。此外,Bt生产许多可能对毒力有贡献的胞外化合物,如磷脂酶、蛋白酶、几丁质酶及其他***如p-外***或VIP蛋白质(Schnepf等,1998)。
尽管过去十年来进行了广泛研究,但只有少数的细菌杀昆虫***大规
模地用于最具破坏性虫害的生物害虫防治应用,例如那些使用Bt植物的应用。
S层是蛋白质原性晶格排列的有序结构,覆盖在许多古细菌和真细菌的表面(Beveridge等,1997;Sara和Sleytr,2000),并构成高达总细胞蛋白质的15%。S层蛋白质的功能还没有被精确地说明,但是认为这些蛋白质参与细胞完整性和形状的维持。因为它们是最外层的细胞被膜组分,
还有人假设其可能参与与环境间的大分子交换(Beveridge等,1997)。在某些革兰氏阴性致病细菌中,它们已经与毒力和补体介导的杀伤抗性相牵连(Sara和SLeytr,2000;Pei和Blaser,19卯)。据描述在蜡状芽孢杆菌中,S层能促进和人类白细胞及与宿主间的相互作用,促成了致病性(Kotiranta等,1998)。认为在炭疽芽孢杆菌(及fl"^,"c&)中,S层和荚膜可能协同地和宿主相互作用(Mignot等,2002)。
已描述了炭疽芽孢杆菌中两种不同的S层蛋白质(SAP和EA1XMignot等,2002)。这些蛋白质的存在并非杆菌正常荚膜化所必需的(Mesnage等,1998)。这些蛋白质以生长阶段依赖性的方式陆续出现,SAP的合成在EA1合成之前(Mignot等,2002)。描述了苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(丑.//rwn'wg/e船/51gfl〃er/fl)的S层蛋白质SlpA,它与炭疽芽孢杆菌的SAP蛋白质类似。在苏云金芽孢杆菌幕虫亚种
(凡幼MnVigiews/ssti6sp./m'ri附附)中描述了S层CTC蛋白质(GenBank登录号AAR23791),此蛋白质和炭疽芽孢杆菌的EA1类似(Sun等,2001)。CTC分子大小为100kDa,并在生长的芽孢形成期能形成类芽孢体。
芽孢杆菌菌林的晶体/芽孢混合物时,存在120kDa的蛋白质。发现溶解、离心并透析之后获得的此晶体/芽孢混合物的上清液能延长用传染性伯氏痴原虫(7Vflw附0(/i'w附Z^rg/ie/)血才羊注射的小鼠的存活。该120kDa蛋白质的N端序列(15个氨基酸)显示出和苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种S层蛋白质N端100%的同源性(Mesimge等,1998报道)。未提供此蛋白质编码基因的核苷酸序列,但据说编码821个氨基酸残基,。在此文献中未测定分离或纯化的蛋白质或生产此蛋白质的重组宿主针对痴原虫感染的功效。并且,此文章中没有保藏或具体描述从中分离这种晶体/芽孢混合物的菌林。
发明概述本发明提供了分离的杀虫ISLP蛋白质,其特征在于
a)对于一些害虫具有特异性杀虫活性,而对于其他害虫则没有,且
b)与细菌S层蛋白质具有至少50。/o的序列同一性,以及这样的蛋白质其与SEQIDNO:2的蛋白质或其毒性片段具有至少50%的序列同一性,且具有大约50到大约120kDa的分子
量。
本文还提供了分离的杀虫ISLP蛋白质,其特征在于
a)对于一些昆虫具特异性杀昆虫活性,而对于其他昆虫则没有,
b)与细菌S层蛋白质具有至少70。/。的序列同一性,
e)大约50到大约120kDa的分子量,以及这样的蛋白质其与SEQIDNO:2的蛋白质或其毒性片段具有至少75%的序列同一性,且具有大约50到大约120kDa的分子量。
根据本发明还提供了如上文所定义的ISLP杀虫蛋白质,含有SEQIDNO:2中始于第1位氨基酸和第31位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列,或者含有SEQIDNO:2中始于第1位氨基酸和第531位氨基酸之间的氨基酸止于第863位氨基酸的氨基酸序列,例如含有SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白质。
本文还包括分离的编码任一上述ISLP蛋白质的DNA序列及嵌合基因,所述嵌合基因包含a)含有这样的DNA的编码序列,及b)允许在植物细胞中表达的启动子。在一实施方案中,这样的嵌合基因含有的编码序列是经优化的合成DNA序列,以便在宿主植物特别是玉米、棉花、大豆、稻、油菜、花椰菜及甘蓝中表达。
本文还提供了含有此类上述嵌合基因的植物转化栽体。
在本发明另一实施方案中,提供了含有任一上述嵌合基因的转基因植
物、种子或植物细胞,特别是玉米、棉花、大豆、稻、油菜、花椰菜及甘蓝的植物、种子或细胞。
虫如昆虫害虫导致的损伤的方法,包括在所述植物的细胞中表达任一上述嵌合基因的步骤;还有保护植物对抗以所述植物所属的植物物种为食的植物害虫例如昆虫害虫导致的损伤的方法,包括以任一上述嵌合基因转化植物细胞,将所述细胞再生为植物,和获得含有任一这类嵌合基因的所述植物的后代或繁殖材料例如种子的步骤。
本发明还提供了用于杀死害虫的方法,包括用任一上述ISLP蛋白质接触所述害虫,特别是这样的害虫是昆虫类害虫的时候;以及保护田间植物对抗害虫如昆虫的方法,包括对田间植物应用任一上述ISLP蛋白质,或者以含有此类蛋白质的杀虫组合物的形式,或者以表达所述蛋白质的重组生物体的形式,特别地,其中所述的生物体是表达此类蛋白质的转基因植物。
本文还提供了编码任一上述ISLP蛋白质或其毒性片段的任一DNA、或任一上述嵌合基因,或任一上述ISLP蛋白质在控制或杀死害虫如昆虫害虫中的用途。
本发明实施方案的详细描述
本发明提供了用于减轻害虫特别是昆虫害虫如鞘翅目(CW^/^ni/i)或鳞翅目(/wVfe/^m)虫害所导致的植物损伤的方法和手段。本发明还提供了与从前描述的核酸序列和蛋白质截然不同的新的核酸序列和蛋白
质。这些核酸和蛋白质能用于控制害虫如昆虫害虫,例如通过在植物或植物细胞中整合并表达至少一种这些新核苷酸序列,或者通过用含有这些核酸分子编码的***的组合物来外部处理植物或植物部分。
本发明提供了新的来自于细菌菌林的杀虫***,及其在控制害虫例如昆虫中的用途。
根据本发明,"核酸序列"意指DNA或RNA分子,是单链或双链形式,其编码本发明的任一ISLP蛋白质。本文使用的术语"分离的核酸序列,,不局限于分离状态的核酸序列,还包括不再处于其分离自的天然环境的核酸序列。因而,才艮据本发明,"分离的ISLP核酸(序列)"或"分离的ISLP蛋白质(序列)"包括相较于原始细菌生物体的另一细菌宿主中或在植物核基因组中的核酸或蛋白质(序列)。根据本发明,术语"蛋白质"或"多肽,,可互换使用,是指由氨基酸链组成的分子,而不考虑任何具体作用方式、大小、三维结构或来源。因
此,本发明ISLP蛋白质的片段或部分在本文仍称为"蛋白质"。本文使用的短语"分离的蛋白质"不局限于分离状态的蛋白质,还包括不再处于其天然环境的蛋白质。蛋白质的天然环境意指在其中该蛋白质能被从自然中找到的环境,即核苷酸序列最初被分离自的菌林。例如,分离的蛋白质可以体外存在,或是在另一细菌宿主或植物细胞中,或者其能分泌自另一细
菌宿主或植物细胞。
根据本发明,编码新ISLP蛋白质的核酸序列,包括DNA序列,已被分离和表征,且通过DNA合***工制备了新形式。本文所述的具体ISLP基因命名为,'W尸7,而它编码的蛋白质命名为ISLP1。
根据本发明,"ISLP"或"ISLP蛋白质"是杀虫、特别是杀昆虫蛋白质,大约40到大约250kDa,特别是约50到约120kDa,或是约60到约100kDa,尤其是大约80或大约100kDa的蛋白质,分离或来源自细菌优选杆菌,和已知的S层蛋白质如苏云金芽孢杆菌CTC的CTC2蛋白质(GenBank登录号AAR23791)具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、优选至少85%或90%的序列同一性或序列相似性;及其任何毒性片段(如本文定义)或变体如前体蛋白质、成熟形式、或与信号肽、与选择性标记蛋白质、或与其他杀虫或杀昆虫蛋白质的融合蛋白质。本文使用的ISLP蛋白质的变体包括与ISLP蛋白质免疫相关的杀虫优选杀昆虫蛋白质,从而它们能被识别ISLP的抗体识别。本发明的ISLP优选来源于或见于厚壁菌门
(F,>w/cwtes)芽孢杆菌纲(5a"'〃i')的细菌中(或其上)。在本发明的另一实施方案中,本发明ISLP来源于或见于芽孢杆菌目(5tf"7/fl&)细菌中
(或其上)。而在本发明另一实施方案中,本发明ISLP来源于或见于芽孢杆菌科(5""7toce"e)细菌中(或其上)。在本发明另一实施方案中,ISLP来源于或见于蜡状芽孢杆菌群细菌中(或其上)、或见于短芽孢杆菌属
(^Mv沩fld//^)或芽孢杆菌属(5tf"7/附),优选蜡状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌(及印/^eWc"s)、炭疽芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(及/Zc/^mybmi&)和苏云金芽孢杆菌中(或其上)。根据本发明的ISLP蛋白质可以在细菌生命周期的营养生长期和/或芽孢形成期产生,并且一般本质上是分泌型蛋白质。根据本发明,ISLP蛋白质的毒性优选是特异性的,从而所述ISLP只对于一些害虫优选昆虫有毒性,而非目标生物如哺乳动物不受影响。本发明的一个实施方案中,ISLP蛋白质对于哺乳动物无毒,或易于在哺乳动物消化系统中被降解。
本文使用的"成熟ISLP蛋白质"意指本发明缺少其细菌信号肽的ISLP蛋白质。本文使用的ISLP蛋白质可以是有全长大小的蛋白质或是截短形式,只要其杀虫例如杀昆虫活性或控制害虫例如控制昆虫的活性能保留即可,或者可以是杂合或融合蛋白质形式的几个蛋白质或蛋白质结构域的组合。
在本发明一个实施方案中,ISLP蛋白质是杀虫蛋白质,特别是杀昆虫蛋白质,特异性地对某些害虫优选昆虫有毒性,能够形成晶体结构如晶格阵列或天然细菌细胞外側的S层。本发明的一个实施方案中,这样的ISLP通常可在分离细菌如苏云金芽孢杆菌
(Bt)的晶体/芽孢制品的操作中被分离或共纯化,不过它们与已知的细菌杀虫或杀昆虫***如苏云金芽孢杆菌Cry、VIP或Cyt蛋白质(见Crickmore等,1998和2005)、或其它已知的杀虫或杀昆虫细菌蛋白质如Bt蛋白质不具显著的序列同一性,优选低于40%、低于30°/。或低于20%的序列同一性。这些ISLP天然地见于细菌细胞壁的外侧r能够在芽孢形成时释放到细菌或芽孢的环境中。
在一实施方案中,ISLP是杀虫特别是杀昆虫蛋白质,包含三个S层同源(SLH)区域,这些区域各自与SEQIDNO:2的S层同源区域具有至少50°/o、或至少60%、或至少70%、特别是至少85%或90%的序列同一性或相似性。本文使用的SEQIDNO:2的ISLP蛋白质的"S层同源区域"是SEQIDNO:2中第34-76位氨基酸的区域、第95-136位氨基酸的区域及第162-198位氨基酸的区域。
如本文定义,本发明还提供了ISLP蛋白质用于控制或杀死害虫例如昆虫的用途,例如通过在田间播种种子或种植表达ISLP蛋白质的植物,或者通过对植物上或动物应用ISLP蛋白质来保护不受害虫例如昆虫损伤。还提供了用于提高产率或增强作物生产力的方法,其包括培养含有编码本发明ISLP蛋白质的DNA的作物的步骤。
根据本发明,提供了用于自杆菌中分离ISLP蛋白质的步骤。在一实施方案中,杆菌在分离ISLP蛋白质之前无需或无需太多的传代培养步骤,因
为延长传代会降低ISLP蛋白质的产量。可选的,自其中分离ISLP的杆菌可以生长在易感害虫优选昆虫害虫中,例如通过将其施加到它们的消化系统或血淋巴中。该杆菌生产的ISLP蛋白质然后可以从害虫如昆虫中例如从它的内脏或淋巴中分离,优选从那些在应用ISLP生产菌之后死亡的或显示出严重的生长抑制的害虫或昆虫中分离。在这个过程中,产生对于某个耙害虫例如昆虫害虫具高毒性的ISLP的细菌将很容易通过它们对于耙害虫的明显效应来鉴定。同样,优选靶害虫和体内靶害虫环境能诱导高水平的ISLP蛋白质。通常ISLP蛋白质能从细菌中分离,例如从培养上清液特别是离心后芽孢形成培养物、或像苏云金芽孢杆菌的Cry蛋白质那样一般被富集和分离。本文使用的术语"杆菌"意指杆状细菌。这些包括芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目或芽孢杆菌科的细菌,例如蜡状芽孢杆菌群的细菌,或芽孢杆菌属的细菌例如苏云金芽孢杆菌。
在本发明的一实施方案中,提供了用于分离新的杀虫优选杀昆虫ISLP蛋白质,特别是对于鳞翅目或鞘翅目昆虫有毒性的ISLP蛋白质的方法。这样的方法包括步骤筛选杀虫(优选杀昆虫)杆菌(优选Bt)培养物中与ISLP具有高度序列相似性的基因,特别是在杀虫(例如杀昆虫)的杆菌菌林(优选Bt菌抹)中,在PCR分析中Cry或VIP基因阴性,特别是在对于某些害虫显示出特异性毒性而不对其它害虫作用的菌林中。这样的具有高度